弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的　扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法　设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论　GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG4基因的克隆、表达和鉴定

目的 对弓形虫表面抗原SAG4基因进行克隆、表达和免疫反应性分析。 方法 根据弓形虫RH株SAG4基因序列（GenBank登录号为AF340224.1）设计引物,体外扩增目的基因,并将其克隆至pMD19-T载体,经PCR和双酶切鉴定并测序,亚克隆至pET28a（+）质粒,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析SAG4重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹（Western blotting）分析该蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清的免疫反应性。 结果 扩增获得的目的基因片段为537 bp。生物信息学分析表明重组基因编码产物为弓形虫SAG4抗原,是一种外膜蛋白。重组菌经IPTG诱导后,以包涵体的形式稳定表达SAG4。Western blotting分析结果表明,诱导表达的蛋白能被弓形虫慢性感染小鼠血清识别,其相对分子质量（Mr）约为18 740。 结论 重组蛋白SAG4有一定的免疫反应性。     

弓形虫RH株ROP1抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达ROP1抗原。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从弓形虫RH株cDNA文库中扩增得到编码ROP1的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并用SDS－PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 （1）在我们比较的1249个碱基中,我们得到的ROP1基因在Ossorio报道的基因的447位与448位之间有一96bp的插入片段,另有14个碱基不同,造成3个氨基酸的改变,两基因之间有91.19%的同源性,（2）得到一分子量约为70kDa的融合蛋白。结论 1,我们获得了一与Ossorio报道的基因有较大差异的rop1基因（GeneBank登录号：AF350261）（2）,ROP1基因在大肠杆菌中得到了ROP1融合蛋白的高效表达。     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定

目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段，并进行序列分析。方法 设计合成引物，从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后，克隆到原核表达质检pGEX-47-2中，转化入大肠杆菌JMl09，用PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因，构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3)，酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3，并经酶切及序列分析所验证，为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的　扩增弓形虫表面抗原P2 2基因编码序列 ,并进行表达和鉴定。　方法　设计合成引物 ,PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P2 2基因编码序列 ,克隆入载体pET 3 2a ,转化大肠埃希菌BL2 1,IPTG诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE和Westernblot鉴定。　结果　从弓形虫基因组DNA中扩增出P2 2基因编码序列 ,并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P2 2。　结论　成功获得弓形虫表面抗原P2 2的表达产物 ,为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的 扩增弓形虫表面抗原P22基因编码序列，并进行表达和鉴定。方法 设计合成引物，PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列，克隆人载体pET-32a，转化大肠埃希菌BL21，IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 从弓形虫基因组DNA中扩增出P22基因编码序列，并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P22。结论 成功获得弓形虫表面抗原P22的表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）棒状体蛋白11（ROP11）的真核表达重组质粒行在真饮细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RTPCR方法扩增ROP11基因并克隆至真干发表达质粕pcDNA3．1（＋）,构建重组表达质粒pcDNA3．1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果RT—PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3．1-ROP11经PCR及EcoRI和NotI双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核什酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99％。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达日的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因,构建表达质粒pBK/P22,并对其在大肠杆菌(E.coli)中的表达作初步研究. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点,构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH 5α,快速酚法初筛阳性重组子,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导在E.coli DH 5α中表达,表达产物以SDS-PAGE与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得约593 bp的P22编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建pBK/P22重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物的大小约28 ku. 结论成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒,诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白,为抗原免疫特性的研究奠定了基础.     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。