大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景：现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件，及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测，于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。 材料：清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品，成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品，二甲基亚砜为Amresco产品。 方法：Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5×107 L-1。设立2组，诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后，再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1，3，5 h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。 结果：预诱导24 h，胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形，伸出多个短棒状突起，可见2~3个核仁，细胞间漩涡状生长趋势消失，排列无规律；诱导1~3 h，细胞逐渐变圆，胞质收缩明显，折光性增强，双级或多极的突起互相连接呈网状；诱导5 h，突起出现一、二级分支。诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白；3 h后巢蛋白达高峰，同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白；5 h后巢蛋白表达下降，神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化，巢蛋白表达为阴性。 结论：在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导，能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化，且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞：最佳诱导剂量筛选☆

背景：目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体。 目的：观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为最适诱导剂量。     

血府逐瘀注射液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的最佳剂量筛选

背景：目前大量研究证明传统中药可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 目的：观察中药血府逐瘀注射液对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找血府逐瘀注射液诱导分化的最佳浓度。 设计,时间及地点：细胞对照观察实验。实验于2009-07/2010-04在 广东医学院附属医院神经病学研究室及中心实验室完成。 材料： 4周龄SPF级SD雄大鼠,体质量约100g;血府逐瘀注射液的主要中药成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,3.00,5.00,10.00 g/L 4种剂量血府逐瘀注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较4种剂量血府逐瘀注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 主要观察指标：骨髓MSCs生长情况和形态观察,骨髓MSCs表面标志物的表达情况及诱导分化后神经细胞特异性标志物的表达。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(96.18±1.65)% CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,3.00 g/L浓度组细胞的巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示血府逐瘀注射液可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,3.00 g/L为最适诱导浓度。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对T细胞增殖的抑制

背景：研究表明骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞的增殖活化,发挥负性免疫调节作用。 目的：利用全反式维甲酸体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,并探讨分化细胞对T细胞增殖的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03在广东医学院完成。 材料：4周龄雄性SD大鼠2只,由广东医学院动物中心提供。新鲜健康人血由广东医学院检验科提供。 方法：通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外传代扩增。取传至5代的骨髓间充质干细胞,加入含0.3 mg/L全反式维甲酸、体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM液进行预诱导,24 h后吸去预诱导液,加入含0.6 mg/L全反式维甲酸的LG-DMEM液向神经元样细胞诱导分化。取新鲜健康人血制备反应细胞,大鼠骨髓间充质干细胞作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞反应实验,设立4组：对照组,单纯反应细胞100 μL,细胞浓度1×109 L-1;实验1组：1×104神经元样细胞+100 μL反应细胞;实验2组：1×105神经元样细胞+100 μL反应细胞;实验3组：1×106神经元样细胞+100 μL反应细胞。 主要观察指标：诱导分化后细胞形态变化及神经细胞鉴定,单向混合淋巴细胞反应结果。 结果：加入诱导液50 min后,光镜下骨髓间充质干细胞呈典型的核周体形态,3 h后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,出现胞体和突起。免疫细胞化学染色结果显示,大部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶及巢蛋白阳性表达,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达。与对照组比较,各实验组放射性核素每分钟闪烁数值均明显减少(P < 0.05),且各实验组间比较差异亦有显著性意义(P < 0.05),随着加入细胞数量的增多,抑制作用越明显。 结论：全反式维甲酸可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,分化后的神经元样细胞能够抑制人淋巴细胞增殖,并呈剂量依赖性增加。     

体外大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞等不同组织细胞多向分化的潜能。方法从SD大鼠股骨骨髓中获得间充质干细胞,原代培养后1∶2传代,传至第5代后分为普通传代培养组、神经细胞诱导组、成骨细胞诱导组和脂肪细胞诱导组。倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况、形态变化以及矿化结节和脂肪细胞的形成;流式细胞检测第5代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45;免疫组织化学检测普通传代培养组和神经细胞诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶等神经细胞相关蛋白的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,细胞扩增至第5代时形态趋于一致,呈梭形。大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)均呈阳性表达,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)无表达。在体外,普通传代培养细胞仅巢蛋白呈阳性表达;由神经细胞诱导的细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,且形态类似神经细胞;由成骨细胞诱导的细胞质内可见矿化结节形成;由脂肪细胞诱导的细胞质内出现多个猩红色呈簇状的脂肪滴。结论大鼠骨髓间充质干细胞易于提取、纯化和扩增,可于体外自发表达神经干细胞标志蛋白,并可通过诱导向神经细胞、成骨细胞及脂肪细胞分化。提示骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,而且可能具有自发向神经干细胞分化的特性。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确。 目的：寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

碱性成纤维细胞生长因子与猴骨髓间充质干细胞增殖及向神经元前体细胞分化：不同质量浓度对诱导剂隐丹参酮作用有差异吗？**

背景：碱性成纤维细胞生长因子属于活性单腱多肽,是一种有效的促有丝分裂因子。 目的：探讨不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子对猴骨髓间充质干细胞增殖及成神经分化的影响。 方法：密度梯度离心法体外分离培养猴骨髓间充质干细胞,传代后设立4组,对照组及低、中、高质量浓度组分别加入0,3,6,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,观察不同条件下猴骨髓间充质干细胞的增殖情况。取传至第5代骨髓间充质干细胞,用含20 mg/L隐丹参酮的无血清L-DMEM培养基向神经方向诱导分化,免疫组化染色检测诱导后巢蛋白阳性的表达。 结果与结论：与对照组比较,低、中、高质量浓度组骨髓间充质干细胞增殖速度明显加快(P < 0.05),并且与培养液中碱性成纤维细胞生长因子的质量浓度呈正相关。隐丹参酮诱导0.5 h后,低、中质量浓度组猴骨髓间充质干细胞均有一定程度的巢蛋白阳性表达;诱导1.5 h后,巢蛋白阳性表达细胞数达峰值,低质量浓度组巢蛋白表达效果明显好于高质量浓度组(P < 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子可以促进猴骨髓间充质干细胞的体外增殖,并且在低质量浓度时能够增加隐丹参酮对骨髓间充质干细胞向神经元前体细胞分化的诱导率,在高质量浓度时则产生相反的抑制作用。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景: 黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为 神经退行性疾病的治疗提供新的方式。 目的：探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点。 设计：细胞学体外观察。 材料：清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108 L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片。盖玻片上细胞达80%~90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接。免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多。 结论：黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化。 关键词：黄芪;骨髓间充质干细胞;神经干细胞;诱导分化     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变

背景：已知端粒酶活性变化与组织工程应用的安全性密切相关，而目前端粒酶在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中的变化及机制研究尚少。 目的： 观察体外人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化。 设计、时间及地点：细胞学开放性实验，于2006-12/2007-11在吉林大学第三临床医院实验中心及基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。 材料：无菌条件下采集非血液系统疾病的志愿者髂骨骨髓，体外分离培养人骨髓间充质干细胞。 方法：取第3代培养的人骨髓间充质干细胞，应用二甲基亚砜/丁羟茴香醚（DMSO/BHA）联合诱导法诱导其向神经元样细胞分化。 主要观察指标：绘制体外培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。免疫荧光及细胞化学染色法分别检测诱导后细胞的巢蛋白和尼氏体的表达，TRAP-ELISA方法检测人骨髓间充质干细胞诱导前后端粒酶活性的变化。 结果： 体外培养的人骨髓间充质干细胞在第3~8代生长较快,第10代以后细胞的生长能力明显减弱。经DMSO/BHA诱导分化后的细胞能够表达具有神经元特征的巢蛋白及尼氏体结构。此外，TRAP-ELISA结果显示诱导2 h细胞端粒酶活性变化不明显，当诱导6 h以后细胞端粒酶活性明显降低，诱导至24 h时，细胞端粒酶活性已近阴性（P < 0.05）。 结论：人骨髓间充质干细胞在体外成功诱导分化为神经元样细胞的过程中端粒酶活性逐渐降低直至消失。     

川芎嗪联合创伤性脑组织匀浆液诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：川芎嗪和创伤性脑组织匀浆液均可诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化。 目的：探讨川芎嗪与创伤性脑组织匀浆液诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的联合效应。 方法：分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞后分为4组,加入不同的诱导培养基分别干预：空白对照组、川芎嗪诱导组、创伤性脑匀浆液诱导组和川芎嗪联合创伤性脑匀浆液诱导组。诱导后采用倒差显微镜观察细胞形态变化,并统计不同时段四组细胞分化率。分别取部分细胞进行神经元特异性烯醇化酶染色,胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学与免疫荧光细胞化学双标检测。 结果与结论：川芎嗪及受损大鼠脑匀浆液上清液可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,随诱导时间的延长,诱导分化率越高,具有较重要的应用价值,而神经元特异性烯醇化酶与胶质纤维酸性蛋白在其分化信号中起重要作用。     

碱性成纤维生长因子等诱导间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的　体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法　采用Ficoll Paque液 (10 77g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,分别采用含碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和叔丁对甲氧酚 (BHA)或硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。结果　成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 5× 10 5,10代可获得 2× 10 10 个细胞。加入bFGF和BHA等诱导剂或硫代甘油诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。结论　成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。     

脑源性神经营养因子诱导大鼠骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化作用的实验研究

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成为神经干细胞及其分化作用。方法取成年大鼠BMSCs,分别以BDNF和BDNF+RA(维甲酸)作为诱导物诱导,于诱导3d、7d后行巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。结果诱导3天后BDNF和BDNF+RA诱导组均有大量Nestin染色阳性细胞,BDNF+RA组阳性率高于BDNF组(P<0.01)。NSE、GFAP免疫阳性细胞在诱导3d后也有少量表达。诱导7天后BDNF和BDNF+RA诱导组Nestin阳性细胞明显减少,与诱导3天后比较差异有显著性(P<0.01),而NSE、GFAP阳性细胞数增多,与诱导3天后相比差异有显著性(P<0.01),且BDNF+RA组阳性率高于BDNF组(P<0.01)。结论联合应用BDNF与RA可提高BMSCs神经转化,并促进其向神经元及星形胶质细胞细胞分化。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经类细胞分化

BACKGROUND： Chemical induction has been shown to be effective at promoting the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs）. However, these inductors have cytotoxicity side effects that may damage cells over time. Traditional Chinese medicines avoid this disadvantage while still producing effective induction.
OBJECTIVE： To investigate the influence of RadixAstragafi （Huangql） on the differentiation of MSCs.
DESIGN, TIME AND SETTING： In vitro study of traditional Chinese medicine in neural stem cell differentiation. The experiment was performed at the Central Laboratory of Hebei North University between April and June 2007.
MATERIALS： Radix Astragafi solution （lot No. 060105; license No. Z53021585） was purchased from Dali Pharmaceutical Co., Ltd., China; rabbit anti-rat nestin, rabbit anti-rat neuron-specific enolase （NSE）, mouse anti-rat microtubule-associated protein 2, and rabbit anti-rat glial fibrillary acidic protein were purchased from Wuhan Boster, China.
METHODS： Whole bone marrow was isolated from the femur and tibia of 6-week-old male Wistar rats and subcultured. The fourth passage of MSCs were harvested and induced by different concentrations （50, 100, 200, 400 g/L） of Radix Astragali.
MAIN OUTCOME MEASURES： Hematoxylin-eosin staining was used to observe MSC morphology after 24 hours of induction. Immunocytochemistry was employed to observe the expression of NSE （specific neuronal marker）, nestin （marker of neural stem cell）, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 （markers of astrocytes）.
RESULTS： Following Radix Astragali treatment, changes occurred in cell morphology including： cell body pyknosis; thin and long processes formed in some cells, with growth corresponding to drug concentration and induction time; and the formation of network-like connections between some cells. With increasing drug concentration and induction time, nestin expression was upregulated, and the number of positive cells increased; cells produced NSE, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2; nestin was expressed earlier than glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 expression. In addition, the number of NSE-positive cells was increased significantly more than glial fibrillary acidic protein-positive cells.
CONCLUSION： Radix Astragafi promoted process formation in stem cells. It may induce the differentiation of MSCs into neural stem cells, and subsequently into neuronal- and glial-like cells. Radix Astragafi exhibits stronger inductive effect on neuronal differentiation than glial differentiation of MSCs.     

Autophagy and apoptosis during adult adipose- derived stromal cells differentiation into neuron-like cells in vitro

β-mercaptoethanol can induce adult adipose-derived stromal cells to rapidly and efficiently differentiate into typical neuron-like cells in vitro.Immunohistochemistry showed that neuron specific enolase and neurofilament-200 expression gradually increased with the extension of induction time,and peaked at 5 hours.By contrast,glial fibrillary acidic protein was negatively expressed at all time points.Induced cells possessed a typical Nissl body,apoptosis showing condensed chromatin in the nucleus,autophagosomes with a bilayered membrane and autolysosomes in the cytoplasm at 5 hours.TUNEL assay and immunohistochemistry and immunofluorescence demonstrated that apoptosis and caspase-3 expression increased and peaked at 8 hours.Immunohistochemistry and immunofluorescence showed that microtubule-associated protein light chain 3 gradually increased with induction and reached a peak at 5 hours.These results indicate that autophagy played an important role in protecting cells during adult adipose-derived stromal cells differentiation into neuron-like cells in vitro.     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：Wnt3a信号分子的诱导作用**★

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。 目的：寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案，通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用，以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。 结果与结论：间充质干细胞经培养、传代后，细胞贴壁生长，形态均一，呈长梭形，流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达, CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性，胶质纤维酸性蛋白无明显表达，诱导后细胞的活力良好；Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达，神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示，Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达，神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带，10 d后更加明显；胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

天然脑活素对骨髓间充质干细胞向神经元定向分化的诱导作用

BACKGROUND： Bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） have been shown to differentiate into neuronal-like cells through the use of several factors, such as 2-mercaptoethanol, dimethyl sulfoxide, or monothioglycero However, these factors are not suitable for human use due to toxicity. Theoretically speaking, traditional Chinese medicine could be used as potential and safe factors. OBJECTIVE： To investigate the effect of natural cerebrolysin on neuronal-like differentiation of MSCs, based on protein and mRNA analyses. DESIGN, TIME AND SETTING： A parallel controlled, in vitro experiment was performed at the Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, between June 2006 and April 2008. MATERIALS： Natural cerebrolysin was provided by Shenzhen Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, China. It primarily consisted of Renshen （Radix Ginseng）, Tianma （Rhizoma Gastrodiae）, and Yinxingye （Ginkgo Leaf） at a proportion of 1：2：2. Natural cerebrolysin extract （1：20） was prepared using conventional water extraction methodology. Each gram of extract equaled 20 grams of the crude drug. Twelve adult, male, New Zealand rabbits were included, six of which underwent intragastric administration of natural cerebrolysin extract （0.976 g/kg per day） for 1 month for natural cerebrolysin-containing serum. The remaining six rabbits received intragastric administration of equal volumes of physiological saline for normal blank serum. METHODS： Sprague Dawley male rats, 6-8 weeks old, were used to harvest tibial and femoral bone marrow. Isolation and purification of MSCs were established from the whole bone marrow by removing the non-adherent cells in primary and passage cultures. For cellular identification, MSCs from four to five passages were co-cultured with LG-DMEM media containing 10% natural cerebrolysin. Simultaneously, MSCs cultured in/G-DMEM media containing 10% blank rabbit serum served as the control group. MAIN OUTCOME MEASURES： Morphology of MSCs and neurite outgrowth during differentiation was observed under inverted phase contrast microscope. Neurite-positive cells were classified by neurite length that was longer than 1.5x the cell body diameter. Immunocytochemistry was used to identify purity of MSCs following passage, as well as expression of nidogen, neuron-specific enolase, glial fibrillary acidic protein, and microtubule-associated protein 2 following treatment with natural cerebrolysin, mRNA expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein was detected using semi-quantitative RT-PCR. RESULTS： After MSCs were treated with natural cerebrolysin for 3-5 hours, the cell bodies were larger, and small neurites - similar to neuronal neurites - were observed. The number of neurite-positive cells significantly increased compared with the control group （P 〈 0.05）. After MSCs were treated with natural cerebrolysin for 12 hours, most expressed nidogen, neuron-specific enolase, and microtubule-associated protein 2 at higher levels than the control group （P 〈 0.01）. No evident expression of glial fibrillary acidic protein was found （P 〉 0.05）. CONCLUSION： Natural cerebrolysin promoted neurite outgrowth and induced neuronal-like differentiation of MSCs.