重组9型腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞

背景：重组9型腺相关病毒对心肌细胞具有良好的亲和力,是目前研究基因治疗心肌梗死的理想载体。目的：观察携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒（r AAV9-e GFP）对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒以不同感染复数（1×105,1×106,1×107）转染体外培养的第4代小鼠骨髓间充质干细胞,并在转染后1-7 d连续用荧光倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达情况,寻找最佳感染条件;采用流式细胞仪检测最佳感染复数下携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。结果与结论：转染后第1天,感染复数为1×107组可见增强型绿色荧光蛋白开始表达,转染后第2天,感染复数为1×105、1×106组开始表达;各组增强型绿色荧光蛋白表达强度随感染复数值的增高而增强,同时增强型绿色荧光蛋白的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第5天达到高峰,此时感染复数为1×107组转染效率约8%,结果表明携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞转染效率较低。     

重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞的体外实验

背景目前应用于基因治疗的病毒载体中,重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较,由于其无致病性,引起学者们的关注.目的观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞,并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性.设计开放性实验.单位南方医科大学南方医院的血液科.材料实验于2004-02/07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成.本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞.方法从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10 mL肝素抗凝的骨髓,分离培养出间充质干细胞,用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞,将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数=1×102,1×103,1×104,1×105,1×106,1×107)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液,10～14 d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达.在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达.体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达.通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后,在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析.②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果①转染率分析增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高,转染率在0.3%～1.4%.转染后10～14 d绿色荧光蛋白开始表达,一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1.030±0.034)%,重复3轮感染条件下为(1.140±0.036)%,脂质体协助感染条件下为(1.380±0.054)%,改变转染条件(包括重复感染,延长感染时间,增加感染复数,脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P＞0.05),而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞.②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析实验观察61 d内,绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1.16%下降到0.5%～0.6%,33～61 d一直维持在这一水平;经过新霉素筛选30 d后,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6.6%左右,在体外继续传代培养,在体外观察的100 d中,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6%的水平.结论重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应,目的基因能够长期稳定表达.重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗,其将来可能成为全身基因治疗的良好载体.     

重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞的体外实验

背景：目前应用于基因治疗的病毒载体中，重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较，由于其无致病性，引起学者们的关注。目的：观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞，并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性。设计：开放性实验。单位：南方医科大学南方医院的血液科。材料：实验于2004-02／07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成。本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞。方法：从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10mL肝素抗凝的骨髓，分离培养出间充质干细胞，用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞，将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数：1&;#215;10^2．1&;#215;10^3，1&;#215;10^4，1&;#215;10^5，1&;#215;10^6，1&;#215;10^7)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液，10～14d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达。在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达。体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达。通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后，在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析。②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①转染率分析：增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高，转染率在0．3％～1．4％。转染后10～14d绿色荧光蛋白开始表达，一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1．030&;#177;0．034)％，重复3轮感染条件下为(1．140&;#177;0．036)％，脂质体协助感染条件下为(1．380&;#177;0．054)％，改变转染条件(包括重复感染，延长感染时间，增加感染复数，脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P&;gt;0．05)，而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞。②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析：实验观察61d内，绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达，在转染后的12～33d，绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1．16％下降到0．5％～0．6％，33～61d一直维持在这一水平；经过新霉素筛选30d后，表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6．6％左右，在体外继续传代培养，在体外观察的100d中，表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6％的水平。结论：重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应，目的基因能够长期稳定表达。重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗，其将来可能成为全身基因治疗的良好载体。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景:由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配,单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想,因此,应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度.目的:观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用.方法:全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞,分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞,设定感染复数值为5×104,观察两组细胞形态改变,分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定,比较两组成骨活性差异.结果与结论:人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后,细胞形态呈现典型的成骨改变,碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变.绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变.人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P<0.01).提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变.     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高（P〈0.05）,MOI值为10的组能获得〉70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较

目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法。方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成。①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率。②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞。转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增。③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率。结果:①脂质体介导的基因转染24h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%。抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆。②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白。当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活。继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白。③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%。但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%。结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因。3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率最低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率最高,最适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯化和扩增,其可能更适合于体内基因直接感染。     

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景:肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成,已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗.目的:鉴于重组腺病毒的宿主范围广,探讨重组腺病毒介导的入肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、日的蛋白表达及细胞活性的影响.设计、时间及地点:2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验.材料:清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠.方法:向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导.以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞.主要观察指标:油红O染色检测成脂情况.流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达,计算转染效率.EUSA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达,MTT法检测转染脂肪细胞的活性.结果:①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴,成脂率(97.31±0.46)%.②以100 pfu/cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72 h后,绿色荧光蛋白表达量达高峰,此时转染效率为65.39%.③以100 pfu/cell作为最佳感染强度转染脂肪绌胞72 h后,肝细胞生长因子的表达量为峰值.与未转染空白对照比较,转染后24,48,72,96,168 h脂肪细胞活性均无明显变化(t=0.024～0.092,P>0.05).结论:重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞,有效表达目的蛋白,且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响.     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比

背景:利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一.目的:观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和Raav2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增值能力的变化.方法:脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部.机械消化和酶消化法分取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增.分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(Raav2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达.Raav2-EGFP转染后,需加入2 Μl丁酸钠(1 mol/L).采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响.结果与结论:体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定.Ad5-EGFP组和Raav2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%.腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高.腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平.