不同冷冻方法对小鼠卵母细胞发育潜能及细胞骨架的影响

目的比较不同冷冻方法对不同成熟阶段小鼠卵母细胞复苏、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵母细胞冷冻方法。方法分别以SOPS玻璃化及慢速法冷冻小鼠中期(MII)和生发泡期(GV)卵母细胞。解冻复苏后,分别作体外培养成熟(IVM)、体外受精(IVF)或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率及纺锤体等细胞骨架指标。结果玻璃化冷冻组MII卵和GV卵母细胞的复苏率及囊胚率均显著高于慢速冷冻组(P<0.05)。慢速冷冻组中MII卵复苏率显著低于GV卵(40.4%vs 57.1%,P<0.01)。但同一种冷冻方法保存的MII卵和GV卵的受精率及囊胚率相比,均无显著性差异(P>0.05)。两组的GV卵成熟率无显著差异。玻璃化冷冻组GV卵的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体正常率均高于慢速冷冻组GV卵但无显著差异。结论玻璃化冷冻能有效改善冻融卵母细胞的复苏及胚胎发育;与MII卵比较,冷冻GV卵对细胞骨架损伤较小;两种冷冻方法均不影响GV卵冻融后成熟。     

两种不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵母细胞纺锤体的影响

目的:探讨两种不同的玻璃化冷冻方案对小鼠第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体的影响。方法:实验分3组:方案A组、方案B组和对照组(新鲜卵母细胞)。均以冷冻环为载体,方案A组用乙二醇(EG)作为冷冻保护剂,方案B组用乙二醇联合二甲亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂,用直接投液氮高速制冷冷冻小鼠卵母细胞;解冻后3h小鼠卵母细胞经固定并用间接免疫荧光法染色微管及染色体,观察纺锤体及染色体的形态。结果:两种玻璃化冷冻方案中,卵母细胞解冻后的存活率差异无显著性(80.3%vs87.5%,P>0.05);经玻璃化冷冻方案A冷冻的卵母细胞解冻后具有完整纺锤体结构的卵母细胞数显著低于对照组和方案B组(15.2%vs78.7%,15.2%vs77.5%,P<0.05),后两者差异无显著性(78.7%vs77.5%,P>0.05);方案A组解冻后具有正常染色体的卵母细胞数显著低于对照组和方案B组(17.4%vs76.6%,17.4%vs72.5%,P<0.05),后两者差异无显著性(76.6%vs72.5%,P>0.05);方案A组异常染色体数显著高于对照组和方案B组(82.6%vs19.1%,82.6%vs27.5%,P<0.05),后两者差异无显著性(19.1%vs27.5%,P>0.05)。结论:改变玻璃化冷冻方案有利于保持解冻后小鼠卵母细胞纺锤体结构完整性。     

应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠囊胚的效果观察

目的比较冷冻环玻璃化冷冻小鼠各阶段囊胚的存活率及继续发育能力。方法应用冷冻环以15%二甲基亚砜(DMSO)+15%乙二醇(EG)为主要组成的玻璃化冷冻液,冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个,以同期未冷冻囊胚(100个)作对照;并于冷冻前人工皱缩小鼠囊胚30个,以同期未皱缩的囊胚(50个)为对照。比较冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果小鼠早期囊胚、囊胚、扩张囊胚各组的存活率分别为88.4%、69.2%和55.2%,囊胚孵出率分别为82.8%、65.1%和60.3%。早期囊胚组复苏后的存活率和囊胚孵出率均显著高于囊胚组和扩张囊胚组(P<0.05)。冷冻前人工皱缩扩张期囊胚,冷冻复苏后存活率达93.8%,孵出率78.1%,与未皱缩组比较差异有显著性(P<0.05)。结论玻璃化冷冻囊胚的效果与囊胚的发育阶段有关;冷冻前人工皱缩囊腔体积能明显提高扩张囊胚玻璃化冷冻的效率。     

冷冻环冷冻促排周期未成熟卵母细胞效果的研究

目的:本文通过对冷冻环冷冻促排周期未成熟卵母细胞后成活率和体外成熟(IVM)能力的比较,及卵母细胞免疫荧光染色后纺锤体和染色体形态的分析,探索未成熟卵母细胞冷冻的方法。方法:获得的GV期卵母细胞随机分为3组:①对照组:GV期卵母细胞体外成熟为MⅡ期(n=68);②GV期冷冻组:卵母细胞在GV期冷冻后体外成熟(n=111);③MⅡ期冷冻组:卵母细胞IVM为MⅡ期予以冷冻(n=69)。获得的MⅡ期卵母细胞予以免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察纺锤体和染色体的形态。结果:GV期冷冻组卵母细胞存活率(89.11%)显著性高于MⅡ期冷冻组(77.05%),而GV期冷冻组卵母细胞的体外成熟率(77.78%)和对照组(86.74%)没有明显的差异(P>0.05)。GV期冷冻组成熟后卵母细胞正常形态的纺锤体(14.1%)和染色体(12.5%)都显著低于对照组(29.1%,32.7%,P<0.05),MⅡ期冷冻组正常形态的纺锤体(11.4%)显著性低于对照组(P<0.05),染色体(15.9%)也低于对照组,但是无显著性差异(P>0.05)。结论:玻璃化冷冻对GV期和MⅡ期卵母细胞纺锤体和染色体都会带来一定的损伤。IVM技术和玻璃化冷冻技术还需要进一步提高。     

海藻糖用于小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的 探讨海藻糖对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响. 方法 采用12只小鼠控制性超排卵获得的360枚成熟的卵母细胞,分别放入含1.0、0.5、0.3及0 mol/L的海藻糖中孵育3h.部分卵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色;320枚卵母细胞进行玻璃化冷冻和复苏,并进行体外受精,观察卵母细胞成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率. 结果 0.3 mol/L海藻糖组复苏率、受精率与对照组无显著差异(92.59％ vs.90.90％,70.67％ vs.61.43％),但是卵裂率、囊胚形成率均高于对照组(83.02％ vs.44.19％,72.72％ vs.47.37％)(P＜0.001);0.5 mol/L海藻糖组复苏率、受精率、囊胚形成率与对照组无显著差异,但是卵裂率高于对照组(65.22％ vs.44.19％)(P＜0.05);0.3 mol/L海藻糖组囊胚形成率高于0.5 mol/L海藻糖组(72.72％ vs.50.00％)(P＜0.001);1.0 mol/L海藻糖组卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均低于对照组低(P＜0.001). 结论 一定浓度范围的海藻糖对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻有保护作用,0.3 mol/L海藻糖浓度比较适合小鼠卵母细胞玻璃化冷冻.     

卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局的影响

目的探讨玻璃化冷冻对卵母细胞体外受精、胚胎发育以及妊娠结局的影响。方法将193枚玻璃化冷冻卵母细胞解冻复苏,采用卵胞浆内单精子注射法受精,观察胚胎发育形态,经72h体外培养后移植。结果成熟卵母细胞解冻复苏率为75．6％,正常受精率为72．6％,卵裂率为88．7％,优质胚胎率为48．9％。共移植19例,9例妊娠,已分娩2例,临床妊娠率为47．3％。新鲜周期与冻卵解冻周期相比,卵裂率、可移植胚胎率和优质胚胎率均无显著性差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻方法对成熟卵母细胞的胚胎发育及妊娠结局无显著影响。     

卵母细胞玻璃化冷冻对早期胚胎发育潜能和卵母细胞特异性基因表达的影响

目的研究玻璃化冷冻-复苏液及冷冻-复苏过程对卵母细胞体外受精后早期胚胎发育潜能及卵母细胞特异性发育相关基因表达的影响。方法 C57BL/6小鼠417枚成熟期卵母细胞随机分为三组,新鲜-对照组154枚,新鲜-复苏液处理组105枚,玻璃化冷冻复苏组158枚,行体外受精比较三组2-细胞率及囊胚率,比较三组卵母细胞特异性基因H1foo、Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox的mRNA表达水平。结果体外受精后玻璃化冷冻复苏组2-细胞率(63.93%)显著低于其他两组(81.25%、77.42%)(P0.05),囊胚率三组无统计学差异。Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox的mRNA表达水平三组无统计学差异(P0.05),H1foo-αmRNA和蛋白表达在玻璃化冷冻复苏组显著低于新鲜-对照组和新鲜-复苏液处理组(P0.05)。结论玻璃化冷冻-复苏液对卵母细胞体外受精后早期胚胎发育及卵母细胞特异性基因表达无显著影响,而冷冻复苏过程会降低体外受精后2-细胞率及H1foo-αmRNA和蛋白表达水平。     

比较四种冷冻载体在水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中的效果

目的探讨不同冷冻载体对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响。方法以体外成熟培养18 h的水牛卵母细胞为实验材料,分别以0.25 ml冻精塑料细管(A)、自制拣卵针尖端部分制成的极细玻璃微管(D)和两种制作核移植工具针的玻璃细管(B、C)为冷冻载体卵母细胞,解冻后统计成熟率及早期胚胎发育率等冷冻保存效果指标。结果A组卵母细胞冷冻保存效果最差(成熟率:A vs B、C、D为43.9%vs 51.7%、51.9%、55.9%,2~4细胞率:A vs B、C、D为34.1%vs 40.0%、40.7%、41.2%),D组卵母细胞冷冻效果最好,但解冻时卵母细胞的回收率显著低于其他组(D vs A、B、C为69.2%vs 87.0%、94.1%、91.9%)。B、C两组在解冻后的成熟率及早期发育率上显著高于A组,低于D组,但差异不明显,且其解冻后卵母细胞回收率显著高于D组(P<0.05)。结论综合回收率和解冻后早期胚胎发育率,B、C两种玻璃细管是一种水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体。     

冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏效果的比较

目的比较冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏的效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者的剩余胚胎进行培养,所获得的囊胚分别进行程序冷冻法或冷冻环玻璃化法冷冻,比较囊胚复苏后的复苏率、妊娠率等指标。结果玻璃化冷冻复苏39个周期,115个囊胚、存活104个(90.4%),移植38个周期、74个囊胚,临床妊娠28个周期(73.7%),其中2例流产,2例足月分娩2个正常新生儿,24例继续妊娠。程序冷冻21个复苏周期,87个囊胚、存活37个(42.5%),移植15个周期、28个囊胚,临床妊娠6例(40%),其中流产1例,2例足月分娩3个新生儿,3例继续妊娠。玻璃化冷冻后的囊胚复苏率显著高于程序冷冻,复苏周期移植取消率显著低于程序冷冻,而临床妊娠率则明显高于程序冷冻,均有统计学差异(P<0.05)。但两种方法的流产率没有显著差异。结论使用冷冻环玻璃化法适于人类囊胚的冷冻保存,其复苏率和妊娠率均显著高于传统的程序冷冻法,复苏周期移植取消率低于程序冷冻法。     

卵母细胞玻璃化冷冻对临床妊娠结局的影响

目的探讨卵母细胞玻璃化冷冻在临床应用中的可行性和有效性。方法回顾性分析2012年1月至2018年12月在我院生殖医学中心行卵母细胞玻璃化冷冻复苏后行ICSI的37例患者(共37个周期)的临床资料(观察组)。采用倾向性评分(PSM)匹配方法按1∶5匹配选择同期在本中心行新鲜卵母细胞ICSI的179例患者(共181个周期)为对照组,比较两组患者的受精率、卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率、种植率、流产率及活产率等妊娠结局。结果 (1)两组患者的一般资料比较均无显著性差异(P0.05)。(2)观察组玻璃化冷冻卵母细胞的复苏率为95.3%(344/361)。两组患者的2PN受精率比较无显著性差异(P0.05);观察组的2PN卵裂率(94.9%vs. 99.0%)、可利用胚胎率(48.1%vs. 58.2%)显著低于对照组(P0.01)。(3)观察组37个周期胚胎移植后,获得20例妊娠,活产19例,分娩25例健康婴儿,无出生缺陷儿发生;对照组181个周期胚胎移植后,获得95例妊娠,活产81例,分娩113例活婴,有1例出生缺陷儿。两组患者的种植率、临床妊娠率、流产率、宫外孕率及活产率比较均无显著性差异(P0.05)。结论卵母细胞玻璃化冷冻保存可获得较好的复苏率,解冻后行ICSI虽然卵裂率和可利用胚胎率略有下降,但并不影响受精率和妊娠结局。对于取卵日男方因各种原因不能提供精液的女性患者,卵母细胞玻璃化冷冻是一个较好的生育力保存方法。     

The outcomes of human blastocyst cryopreservation:vitrification using cryoloop versus slow-freezing method

<正> Objective:To compare the outcomes of vitrification using cryoloop with slow-freezing meth-od for human blastocyst cryopreservation.Methods:In IVF-ET cycles,supernumerary embryos were cultured to Day 5 or Day 6,blas-tocysts were cryopreserved by vitrification using cryoloops or slow-freezing method,then blasto-cyst survival rate and pregnant rate were compared.Results:115 vitrified blastocysts from 39 cycles were warmed,104(90.4%)blastocysts sur-vived.After the transfer of 74 blastocysts in 38 cycles,28(73.7%)women got clinically preg-nant,2(7.1%)of them suffered from miscarriage,2 healthy babies were born in 2 deliveries,and the other 24 pregnancies are ongoing.As to slow-freezing method,87 blastocysts from 21 cy-cles were thawed,37(42.5%)of them survived,28 blastoeysts were transferred in 15 cycles,6(40%)women got clinically pregnant,1 of them miscarried,3 healthy babies were born in 2 de-liveries,and the other 3 pregnancies are ongoing.Conclusion:The survival rate and pregnant rate of vitrification using cryoloop are superior totraditional slow-freezing method,and the transfer cancel rate is lower than that of slow-freezingmethod.The miscarriage rate is similar in two methods.     

卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植中的初步应用

目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗中的卵子冷冻保存临床应用的可行性及其指征和方法,以提高卵子利用率和减少卵子的废弃。方法:在我院生殖医学中心进行IVF-ET治疗的患者,在取卵日因男方因素无法进行受精者或获卵数超过25枚,进行知情同意后对部分卵子进行玻璃化冷冻保存。将冷冻保存卵子解冻后继续使用,或捐赠给需要受卵患者。结果:2009年10月至2011年6月,已有7例患者的卵子进行了复苏。共复苏卵子53枚,存活44枚,复苏率83.02%;有41枚MⅡ卵子行ICSI,受精32枚,受精率72.73%;形成30枚胚胎,卵裂率93.75%,获有效胚胎23枚。9个移植周期移植胚胎16枚,临床妊娠2例,分娩3个健康婴儿,胚胎种植率18.75%,活产率22.22%。剩余冷冻胚胎7枚。结论:卵子的玻璃化冷冻保存,可以获得比较满意的复苏率和受精率;将获卵较多的患者进行部分卵子的冷冻保存可以提高卵子的利用率,可以作为临床治疗的一个可选择的方法。     

玻璃化冷冻不同来源卵母细胞的临床研究

目的 探讨玻璃化冷冻对卵巢刺激（ovarian stimulation,OS）和控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation,COH）来源的卵母细胞影响.方法 对OS和COH来源的卵母细胞进行玻璃化冷冻,解冻后观察存活率,继续发育潜能及移植后的妊娠率并与COH来源的新鲜卵母细胞进行比较.结果 OS和COH来源的卵母细胞玻璃化冻融后的存活率和继续发育潜能无统计学差异（P＞0.05）,与新鲜卵母细胞差异无统计学意义（P＞0.05）.COH冷冻组和OS冷冻组的妊娠率和种植率分别是25.0%（3/12）、20.8%（5/24）和33.3%（1/3）、12.5%（1/8）.结论 玻璃化冷冻技术可以应用于OS和COH来源的成熟卵母细胞的冷冻保存,对其继续发育潜能和妊娠结局无显著影响.     

冻融液的温度对人未成熟卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

目的探讨冻融液的操作温度对未成熟人卵母细胞（GV、MI）玻璃化冻融效果的影响。方法收集卵胞浆内单精子注射（ICSI）患者的GV、MI卵母细胞,根据冻融液操作温度的不同分为A、B、C组。冻融后存活及未冷冻对照组（D组）卵母细胞体外成熟（IVM）培养,成熟的M11卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用NikonCISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态。结果实验组GA、GB、GC卵母细胞冻融后的存活率和体外成熟率分别为100％、81．3％、68．8％和33．3％、83．3％、72．7％,仅GC组的存活率与对照比较存在显著性的差异（P〈70．05）;实验组中只有GB组获得了纺锤体（20％）和染色体（10％）形态正常卵母细胞。实验组MA、MB、MC卵母细胞冻融后的存活率分别为71．4％、100％、83．3％,各实验组与对照组比较无显著性差异（P〉0．05）;MA组体外成熟率与对照组比较存在极显著性的差异（0％比57．1％,P〈0．01）,MB、MC与对照组的体外成熟率比较无显著性的差异（66．7％、80％比57．1％,P〉0．05）;仅MC获得1个正常纺锤体和染色体形态卵子。结论冻融液的合适操作温度可以提高未成熟卵子的冻融效果。