HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能。方法针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照。转染48h后,应用半定量RT-PCR,Westernblot检测HeLa细胞HSP70mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。结果与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48h时细胞抑制率达到最大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G0/...     

siRNA-FAM92A1-289对HeLa细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)沉默基因FAM92A1-289对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法:化学合成法合成小干扰RNA(siRNA),阳离子脂质体转染FAM92A1-289 HeLa细胞;实时定量RT-PCR检测其mRNA表达,MTT法和流式细胞仪检测转染后HeLa细胞增殖、细胞周期和凋亡变化。结果:转染合成FAM92A1-289 siRNA后,HeLa细胞中FAM92A1-289 mRNA表达下降(P<0.01),细胞增殖均明显增强(P<0.01);细胞周期分布改变,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞减少,凋亡率无变化。结论:FAM92A1-289基因调节细胞增殖活动。     

RNA干扰技术对HeLa细胞hTERT基因的抑制作用

目的 探讨RNA干扰对宫颈癌HeLa细胞人端粒酶反转录酶基因的抑制效应。方法 化学合成靶向于hTERT基因的siRNA,用阳离子脂质体转染法将其导入宫颈癌细胞内。实验分组:转染组siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、阴性对照组(siRNA-NC)、空白对照组(Blank)。通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 siRNA-3组的端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平显著下降,hTERT蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显升高,与其他各组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 运用RNAi干扰技术,以hTERT基因为靶点的siRNA能特异性抑制宫颈癌HeLa细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制宫颈癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据。     

RNA干扰抑制环氧化酶-2表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的 建立以小分子干扰RNA(siRNA)抑制环氧化酶-2(COX-2)表达的宫颈癌HeLa细胞模型,探讨COX-2在肿瘤细胞增殖、凋亡方面的作用和可能机制.方法 构建靶向抑制COX-2的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,Western blot法确定筛选的稳定表达siRNA的转化克隆COX-2表达受抑制;流式细胞仪检测RNA干扰(RNAi)抑制COX-2表达后细胞凋亡和细胞周期的变化;克隆形成试验检测细胞克隆形成率;RT-PCR及Western blot法检测ku70、ku80的表达变化.结果 获得稳定表达siRNA的转化细胞株(HeLa/COX-2i),其COX-2蛋白表达明显受抑制,而转入阴性对照质粒的细胞株(HeLa/Negi)COX-2蛋白表达不受影响;HeLa/COX-2i细胞的克隆形成率[(45±4)%]显著低于HeLa细胞[(85±7)%](P<0.01);HeLa,HeLa/Negi,HeLa/COX-2i 3株细胞的细胞周期分布以及细胞凋亡率差异无显著性意义;RT-PCR及Western blot显示RNAi抑制COX-2表达后ku70、ku80在转录和翻译水平均受抑制.结论 RNAi抑制COX-2表达后可抑制HeLa细胞增殖,其机制可能与ku70、ku80的表达下调有关.     

细胞周期素E的干扰RNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNAi技术下调宫颈癌HeLa细胞中cyclin E mRNA水平,研究对HeLa细胞增殖及周期的影响.方法 构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,脂质体转染HeLa细胞下调细胞中cyclin E mRNA含量.RT-PCR检测抑制效果;MTT检测细胞生长情况;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化.结果 成功构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体,可以特异下调cyclin E mRNA含量,并抑制细胞恶性增殖.细胞周期分析显示干扰使细胞停留在G0～G1期,S期细胞明显减少.结论 RNAi能特异地下调HeLa细胞中cyclin E mRNA含量,抑制宫颈癌细胞恶性增殖,提示cyclin E可能成为宫颈癌基因治疗中的一个新的靶点.     

RNAi沉默Furin基因对人宫颈癌HeLa细胞增殖和转移的影响

目的研究Furin基因沉默对宫颈癌HeLa细胞株生长转移的影响。方法脂质体法将质粒Furin siRNA转染人宫颈癌HeLa细胞。MTT法检测细胞的增殖情况,Boyden细胞迁移和侵袭实验观察HeLa细胞的迁移和侵袭能力。Western blot检测Furin及产物MT1-MMP蛋白量的变化,ELISA法检测细胞上清中MMP2的浓度。结果细胞增殖实验中Furin siRNA处理后48h的HeLa细胞与空质粒转染组相比体外生长抑制38.6%,差异有统计学意义(P<0.01);细胞迁移和侵袭实验中,Furin siRNA处理后,HeLa细胞穿过滤膜和基质胶的细胞数量均明显少于空质粒转染(P<0.05);它可显著降低MT1-MMP蛋白表达及MMP2的分泌。结论 Furin siRNA可有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长及肿瘤细胞转移,机制可能与降低Furin产物MT1-MMP的表达及MMP2合成有关。     

核仁素表达下调对宫颈癌细胞Hela生物学行为的影响

目的 探讨核仁素表达下调对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响。方法 实验分4组：3个靶向人核仁素基因的实验组(siN1组、siN2组、siN3组)及1个阴性对照组(NC组)。体外化学合成各组siRNA并转染HeLa细胞;利用荧光实时定量RT-PCR法和Western blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率最高的片段;利用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测核仁素下调对HeLa细胞增殖活性的影响;利用流式细胞学Annexin V-FITC检测转染后HeLa细胞凋亡率的改变;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变。结果 与NC组相比,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P<0.05);蛋白表达水平也相应下调(P<0.05)。成功筛选出最佳干扰片段siN2,用于后续实验。siN2组HeLa细胞生长速率明显受到抑制(P<0.05);流式细胞学Annexin V-FITC检测siN2组HeLa细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05);Transwell实验显示siN2组HeLa细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。结论 核仁素表达下调明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。     

RNA干扰TMEM33的表达对宫颈癌细胞生长的影响

目的 通过生物信息学方法探究跨膜蛋白33(transmembrane protein 33,TMEM33)在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系,观察TMEM33经RNA干扰后对宫颈癌细胞生长的影响。方法 应用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库筛选出与宫颈癌相关的TMEM33基因,设计两条特异siRNA序列进行RNA干扰实验。实验分为3组：siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组（非特异性siRNA）。采用Western blot法检测siRNA干扰后宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达,CCK-8法检测SiHa/HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blot法检测细胞凋亡关键基因BCL-2、Bax及细胞周期蛋白CyclinD1、P21的表达变化。结果 与阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达（P<0.05）;宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加,...     

RNA干扰TMEM33的表达对宫颈癌细胞生长的影响

目的 通过生物信息学方法探究跨膜蛋白33(transmembrane protein 33,TMEM33)在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系,观察TMEM33经RNA干扰后对宫颈癌细胞生长的影响。方法 应用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库筛选出与宫颈癌相关的TMEM33基因,设计两条特异siRNA序列进行RNA干扰实验。实验分为3组：siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组（非特异性siRNA）。采用Western blot法检测siRNA干扰后宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达,CCK-8法检测SiHa/HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blot法检测细胞凋亡关键基因BCL-2、Bax及细胞周期蛋白CyclinD1、P21的表达变化。结果 与阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达（P<0.05）;宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加,...     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.