HCMV gp52基因的克隆与表达

目的：克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)gp52基因，制备特异性抗原，用于HCMV早期诊断。方法：从感染的HCMV细胞上清液中提取病毒的DNA，用PCR扩增gp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段，并将其克隆到pGEM-Teasy载体测序，然后将其克隆到含有谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5x-3中表达，表达产物经GST亲和层析柱纯化后，采用ELIA和免疫印迹(Westem blotting)检测重组蛋白的抗原性。结果：经序列测定gp52基因片段的序列正确，并在pGDX-5x-3表达载体中得到了高效表达。表达的融合蛋白用亲和层析柱纯化后经免疫印迹和ELISA分析具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清呈特异性反应。结论：通过基因工程制备的重组gp52蛋白可作为抗原用于HCMV感染者的早期诊断。     

抗原决定簇预测在HCV NS5区基因表达研究中的应用

目的：利用生物信息技术，对丙型肝炎病毒ＮＳ５区抗原决定簇进行预测分析，获得具有良好抗原的重组蛋白。方法 以Ｇｏｌｄｋｅｙ程序，通过综合亲水参数、可及性参数、柔韧性参数、抗原性参数，氨基酸序列的电荷分布和β折叠等多种指标，对ＨＣＶ ＮＳ５区抗原决定簇进行预测分析，克隆并表达部分ＮＳ５区基因。结果：发现７个可能性最大的抗原决定簇肽段，在此基础上表达的ＮＳ５反应融合蛋白可与丙型肝炎病人血清发生特异性反应     

人端粒酶反转录功能区基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

 目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础.方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能所需的全部8个基序长为1 310 bp的基因片段,将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET-32a中,IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE和Western-Blot(WB)检测确定表达出端粒酶反转录酶功能区融合蛋白,以8 M尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白,用金属鳌合层析柱纯化融合蛋白并对之进行复性.结果经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE和WB鉴定证实成功构建了表达质粒pET32a-hTERT,鉴定和测序结果亦证实包含全部8个基序的基因片段,凝胶电泳和WB确认表达出特异性的目的蛋白条带.结论成功构建pET32a-hTERT表达质粒,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得特异性的hTERT重组蛋白.     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

转移正相关基因mag-1的原核表达及抗体制备

目的:克隆人mag1-基因,在大肠杆菌中进行表达并制备其抗体。方法:利用PCR方法从含有mag1-基因全长序列的pcDNA3-mag1-质粒上扩增mag1-基因开放阅读框(ORF),将其插入表达载体pET-28 a( )中,构建重组表达载体pET-28 a-mag1-,用IPTG诱导目的基因在E.coli中的表达,并通过W estern印迹方法对表达产物进行鉴定。表达产物经过初步纯化后作为抗原免疫兔制备多克隆抗体。结果:所获得的序列经测序分析与源序列一致;SDS-PAGE分析表明,经0.1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h后在E.coli中有大量的融合蛋白表达,相对分子质量约为18×103。W estern印迹分析提示,诱导表达产物能与H is单抗发生特异反应。ELISA结果表明获得了高效价的多克隆抗体。结论:获得了H is-mag1-融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,并制备了其相应的多克隆抗体。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析

目的：获得尖吻蝮蛇去整合素基因，并分析重组蛋白生物学活性。方法：提取尖吻蝮蛇毒腺组织总RNA．经RT—PCR获得去整合素基因片段。将该去整合素基因片段重组入pMAL-p2x栽体中诱导表达，以直链淀粉树脂柱亲和纯化，并检测融合蛋白的抑制血小板聚集活性。结果：谊片段编码的氨基酸序列中含有去整合素保守的RGD三肽序列及12个Cys残基，与GenBank中其他蛇毒去整合素氨基酸序列最高同源性为86％，重组融合蛋白具有抑制ADP诱导的血小板聚集活性。结论：发现了一个新的去整合素基因，谊基因编码蛋白具有抑制血小板聚集的功能。     

人oGPCRs与Gi1α的基因融合及其在昆虫细胞Sf9的表达

目的获得人孤儿G蛋白偶联受体（oGPCR）与G蛋白α亚基（Gi1α）的融合基因及其表达蛋白。方法采用RT-PCR法,从人HepG2细胞扩增oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174和Gi1α的完整表达序列,运用重叠延伸PCR法扩增得到人oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174分别与Gi1α的融合基因,将各融合基因与供体质粒pFASTBac1重组,而后分别转化DH10Bac菌株获得杆状病毒穿梭杆粒,制备重组杆状病毒并感染Sf9细胞,收获融合蛋白,经Western印迹鉴定。结果得到了上述oGPCR成员的融合基因oGPCRs-Gi1α,并使之在昆虫细胞成功表达,制备了足量的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。结论oGPCR可与Gi1α成功融合,昆虫细胞表达体系是制备融合蛋白的理想手段,为今后深入开展oGPCRs的相关研究提供了保障。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力蛋白NleB1的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定

目的：构建肠出血性大肠杆菌（ EHEC） O157∶H7毒力蛋白nleB1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备NleB1的抗血清。方法从EHEC O157∶H7 EDL933株的全基因组中PCR扩增出编码nleB1的990个碱基序列,构建原核表达载体pET24a-nleB1,将构建的重组表达载体的质粒pET24a-nleB1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白His-NleB1表达,并利用镍柱进行亲和层析纯化和切胶纯化,以纯化后的融合蛋白His-NleB1为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清。 Western印迹和ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建了pET24a-nleB1原核表达载体,纯化得到融合蛋白His-NleB1,进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western印迹和ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了EHEC O157∶H7的毒力蛋白NleB1的多克隆抗体,为研究EHEC O157∶H7毒力蛋白NleB1的功能奠定了基础。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

一种新的人端粒相关蛋白T-STAR 的克隆及功能分析

目的 筛选、鉴定新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶全酶的结构、生物学功能及其作用机制奠定实验基础。方法 采用研究蛋白质间相互作用非常有效的分子生物学方法酵母双杂交技术、哺乳细胞双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选、鉴定。结果 成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，无自身激活活性，pG—BKT-7hTERT融合蛋白在酵母细胞AH109内有效稳定表达。以pGBKT7-hTERT为诱饵进行cDNA库筛选，将阳性克隆质粒cDNA测序，同源性比较获得了已收录人cDNA序列T—STAR。成功构建真核表达载体pVP16-T-STAR、pM—hTERT，证明T-STAR与hTERT在哺乳细胞内发生相互作用。T—STAR mRNA在正常胃粘膜组织低表达，在胃癌细胞内高表达。结论 T—STAR是人端粒相关蛋白新成员，可能参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入hTERT的磷酸化或去磷酸化调节端粒酶的活性。     

hTERT基因反义核酸对Hela宫颈癌细胞端粒酶活性的影响

研究人类端粒酶催化亚单位（hTERT)基因的反义寡核苷酸对宫颈癌细胞的影响。方法：采用TRAP－ELISA检测Hela细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化。结果：hTERT基因反义核酸能有效抑制Hela细胞端粒酶活性。结论：hTERT基因反义核酸能显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，为肿瘤治疗提供了一个有效的新途径。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体，转染大肠杆菌并诱导其表达。方法：将人caspase—8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase—8基因克隆人原核表达载体pBV220，转染大肠杆菌并诱导表达。结果：成功构建了三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后，经温度诱导，重构型人caspase—8基因获得了高效的表达。结论：在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase—8基因。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

RNA干扰抑制端粒酶反转录酶联合γ射线对人喉癌细胞的作用

目的 观察人端粒酶反转录酶特异性干扰载体(pshRNA-hTERT)联合放射线在细胞和动物模型水平上对人喉鳞癌Hep-2细胞株的生长抑制作用,研究抑制hTERT在放射增敏中的作用。方法 细胞水平:联合pshRNA-hTERT和γ射线作用于人喉癌细胞Hep-2,用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,彗星电泳检测DNA损伤;动物水平:建立Hep-2和Hep-2R移植瘤模型,瘤内注射pshRNA-hTERT并联合放射线观察对移植瘤的抑制作用,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测肿瘤内hTERT蛋白的表达。 结果 转染pshRNA-hTERT后Hep-2细胞hTERT的mRNA表达抑制率为60.78%;pshRNA-hTERT不仅能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性,而且抑制照射后DNA损伤的修复;在移植瘤模型中,pshRNA-hTERT与放射线有协同抑制移植瘤生长的作用(Hep-2:EPO＝1.79;Hep-2R:EPO＝2.01)。结论 pshRNA-hTERT在细胞和动物实验水平均具有放射增敏作用,表明抑制端粒酶及其亚单位可以增加在体肿瘤的放射敏感性,这为喉癌的基因放疗研究提供了依据。     

端粒酶催化亚基基因表达激活人胚肺成纤维细胞端粒酶活性

目的 :通过端粒酶催化亚基基因转入人胚肺成纤维细胞 ,激活人胚肺成纤维细胞端粒酶活性 ,探讨其在延缓细胞衰老中的作用。方法 :用PCI_hTRT质粒转染人胚肺成纤维细胞 ,G4 18筛选获得稳定表达端粒酶活性的人胚肺成纤维细胞 ,采用RT_PCR和TRAP法分别测定端粒酶催化亚基mRNA和端粒酶活性表达情况。结果 :获得了表达端粒酶活性的人胚肺成纤维细胞 ,其寿限长于正常人胚肺成纤维细胞。结论 :端粒酶催化亚基异位表达可以激活人胚肺成纤维细胞的端粒酶活性 ,并延长人胚肺成纤维细胞的寿命