中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定

首次报道了中国人庚型肝炎病毒基因ｃＤＮＡ的克隆及序列测定。中国庚型肝炎病毒基因全长为９１２８个核苷酸，编码一个长度为２８７０个氨基酸残基的多聚前体蛋白。     

未知cDNA扩增与亚克隆的方法学研究

新型蛋白质的分子克隆基本依靠ｃＤＮＡ文库的筛选，而文库构建的载体多为λｇｔｌｌ。由于λｇｔｌｌＤＮＡ分子量较大（４９ｋｂ），提取过程中多用ＰＥＧ，因此λｇｔｌｌｃＤＮＡ克隆及其直接序列测定极为困难。为克服此困难，作者自行设计了不含克隆位点的一对公用λｇｔｌｌＰＣＲ引物。试用表明，此引物通过改变ＰＣＲ反应条件，可特异性地扩增多种彼此独立的ｃＤＮＡ。经亚克隆后的序列测定表明，用此方法扩增克隆的多种ｃＤＮＡ保留了原有阅读框架和ｐｏｌｙＡ特有序列，因而基本解决了新型蛋白质分子克隆中ｃＤＮＡ亚克隆与序列测定的困难．     

中国人庚型肝炎病毒（HGV）部分基因的克隆和cDNA序列测定

中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）部分基因的克隆和ｃＤＮＡ序列测定周育森王海涛唐时幸王竟陈薇赵秋敏张习坦军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１０００７１在急、慢性输血后肝炎、散发性肝炎及暴发性肝炎中，有相当比例的病人用现有甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的诊断...     

小鼠神经生长因子cDNA的克隆及核苷酸序列分析

用Ｔ４－ＤＮＡ连接酶在限制性内切酶ＳｍａＩ存在下，将神经生长因子ｃＤＮＡ片断克隆到具有双向转录启动子的载体质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中。Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定其核苷酸顺序表明，所克隆的ＮＧＦｃＤＮＡ片断，长３６３ｂｐ，包含了成熟神经生长因子的全部编码。该重组质粒可分别用于制备ＮＧＦｃＤＮＡ探针和ＲＮＡ探针，是研究ＮＧＦ基因结构及表达调控等方面的重要工具。     

内皮素A型受体胞内区cDNA的克隆及序列分析

内皮素Ａ型受体胞内区ｃＤＮＡ的克隆及序列分析研究简报文立民张兆山李淑琴黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）是一种血管活性多肽，它是迄今所知体内最强烈、最持久的血管收缩因子，它不仅可促进血管收缩，而且可刺激心...     

人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析

利用大鼠肝再生增强因子核苷酸序列，从人胎肝ｃＤＮＡ文库中筛选到人肝再生增强因子ｃＤＮＡ克隆，该克隆含有１．５ｋｂ的外源插入片段，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核到序列同源性达８７％，氨基酸序列同源性达８４．８％。     

小鼠骨髓组织4种造血生长因子受体cDNA片段的克隆和序列测定

目的：探索大剂量照射后造血生长因子受体基因的表达规律。方法：应用逆转录PCR技术，从小鼠骨髓造血组织中扩增出造血生长因子受体的目的片段，PCR产物与克隆载体连续后转化感受态大肠杆菌，阳性菌落提取质粒后进行序列测定。结果：4种造血生长因子受体片段均扩增成功，PCR产物经测序证实。结论：粒细胞集落刺激因子受体（G－CSFR），促红细胞生长素受体（EPOR）、促血小板生成素受体（c-mpl)和干细胞因子受体（c-kit)cDNA片段的克隆成功，从为整体水平上研究照射后造血生长因子受体的表达规律打下了基础。     

人红细胞单链抗体基因的克隆及其序列分析

目的：获得抗人红细胞的单链抗体基因。方法：以分泌抗人红细胞单抗（ＨＲＣ）的杂交瘤细胞总ＲＮＡ为模板，分别扩增出轻链可变区（ＶＬ）和重链可变区（ＶＨ）基因，用连接肽将其连接成具ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ结构的单链抗体基因。结果：ＤＮＡ序列分析证实，获得的单链抗体基因的轻，重链分别属于鼠Ｉｇｋａｐｐａ轻链第Ⅲ亚组和Ｉｇ重链第Ⅱｃ亚组，结论：构建了抗人红细胞单链抗体的载体，提供了与其它基因连接，为建立病人     

中国人TTV部分基因的克隆及序列测定

目的：了解我国人群中是否存在ＴＴ病毒（ＴＴＶ）感染，分析国内ＴＴ病毒株基因结构特点。方法：用ＰＣＲ方法检测血清标本中ＴＴＶ ＤＮＡ，对ＴＴＶ ＤＮＡ阳性的标本进行序列测定。结果：１０例临床诊断为非甲至非戊型肝炎病人血清标本中，用ＰＣＲ方法检测出５例为ＴＴＶ ＤＮＡ阳性。将其中的一株命名为ＴＴＶＣＨ１（ＴＴＶ中国株１）并进行序列测定，该序列与日本ＴＴＶ部分基因（ＣＬＯＮ２２）相对位置的核苷酸同源性为     

重组人白介素10基因的克隆和序列测定

目的 :提取正常人IL 10基因。方法 :利用RT PCR方法 ,自行设计并合成一对引物。结果 :成功地从活化的正常人外周血单个核细胞扩增出hIL 10cDNA ,并定向克隆入pUC18中 ,经过序列测定证实 ,为IL 10成熟肽cDNA基因。结论 :IL 10基因的获得 ,为进一步在大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL 10 ,更深入地研究其作用机理 ,以及临床应用奠定了基础。     

SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA的构建与鉴定

目的:构建我国自行分离的SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,为阐明SARS病毒致病的分子机制奠定基础。方法:采用分段克隆的方法对病毒全基因组进行分段扩增和克隆,然后将全基因组各cDNA片段分别进行体外连接获得全长cDNA分子,并对其接头序列进行PCR扩增和测序鉴定。结果与结论:获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,对其接头处序列的测定结果表明,该全长cDNA分子为SARS病毒BJ01株的特异序列。     

均聚物接尾法克隆双链cDNA

采用d(G)、d(C)均聚物接尾法克隆了双链cDNA,并通过电泳和酶切试验分析了重组体质粒中所含双链cDNA插入物的大小。试验中观察了RNA对接尾及转化试验的影响,并作了相应技术改进。     

SARS病毒基因的PCR扩增及序列测定

目的 利用RT—PCR技术检测SARS疑似或临床确诊病人咽拭子、血清及自细胞中的SARS病毒，并分析了扩增产物内一个可能的突变位点。方法 采用Trizol试剂或病毒RNA提取试剂盒，抽提SARS疑似患者咽拭子、血清及外周血白细胞中的RNA，进行RT—PCR和nest PCR反应，检测SARS病毒RNA，并对扩增产物进行DNA测序。结果 14例SARS疑似患者中2例咽拭子RT—PCR结果阳性，约占14％；5例临床确诊病人中2例咽拭子nest PCR结果阳性，约占40％；6例临床确诊SARS病人中1例血清nest PCR结果阳性，占17％，其他5例疑似患者结果阴性；在22份疑似患者外周血白细胞中未检测到SARS病毒；扩增产物DNA序列与美国和加拿大在GenBank中报道的序列一致。结论 RT—PCR方法是一种快速有效的SARS病毒检测手段，为临床诊断及发病机制研究提供了依据；扩增片段内未发现突变。     

我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建我国SAILS病毒BJ01株基因组全序列的cDNA克隆，为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法：根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点，利用DNAstar软件设计7对引物。然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体。结果与结论：已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆，经酶切鉴定和序列测定表明，所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列。     

斜带石斑β-珠蛋白cDNA的克隆和序列分析

从斜带石斑Epinepheluscoioides白细胞cDNA文库随机挑取噬菌斑 ,做为模板 ,用λTriplEx5’3’长距离插入子筛选引物 ,进行插入片断的PCR扩增 ,并进行表达序列探针 (ESTs)测定。从中克隆到了血红蛋白β亚基cDNA。cDNA包含长达 4 4 4bp的开放阅读框 ,编码 1 4 7个氨基酸的多肽。用www .expasy .ch网站的computepl/MW程序计算其可能的相对分子质量为 1 65 4 4 ,等电点为 6 .95。其氨基酸序列与草鱼β -珠蛋白III的同源性最高 ,为 73.0 %。在远端和近端的与血红素结合的组氨酸都是保守的。另外 ,与其它鱼类及蛙、鸡和人的 β -珠蛋白比较 ,在血红素结合区及亚基结合区的氨基酸残基均是高度保守的     

人胰岛素原基因的PCR扩增、克隆和鉴定

根据已知的人胰岛素原基因序列设计引物 ,用PCR直接从人基因组DNA中获得天然的人胰岛素原基因 ,并将其克隆到 pUC1 8载体中 ,通过内切酶图谱及序列分析 ,证实所获得的人胰岛素原基因与已报道的序列完全一致。对于已知序列的基因克隆 ,PCR扩增法操作简捷 ,结果可靠     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

蛋白激酶Cδ亚型cDNA的克隆及其序列分析

 目的 研究中国仓鼠卵巢上皮细胞是否表达蛋白激酶Cδ亚型.方法 参照GeneBank数据库PKC δ亚型的cDNA序列;通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKC δ亚型的特异引物;RT-PCR扩增CHO细胞PKC δ亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKC δ连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKC δ亚型.结果 运用RT-PCR和Western blotting技术证实CHO细胞表达PKC δ亚型,并经测序证实.结论 CHO细胞中发现PKC δ亚型的存在,为深入研究PKC δ亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础.     

人转化生长因子β1基因非翻译区的改造及其全长序列测定

通过ＰＣＲ和体外重组技术对ＴＧＦβ１基因５＇和３＇非翻译区进行了改造，在此基础上，通过构建缺失突变体，采用双脱氧终止法，利用ｐＵＣ／Ｍ１３系统测定了人ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ的全长序列。这为今后研究不同长度非翻译区对ＴＧＦβｃＤＮＡ表达水平的影响并实施其高效表达奠定了基础。