心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ在急性心肌梗死诊断中的应用

目的 比较心肌肌钙蛋白I（cTnI)与常用的急性心肌梗死（AMI）诊断标志物肌酸激酶同功酶（CK－MB）的临床应用价值。方法 采用31例AMI病人的同一血标本，同时检测cTnI和CK－MB，然后进行两者比较。结果 cTnI对急性心肌梗死诊断的敏感性和特异性高于CK－MB，其敏感性分别为96．7％和80．6％，P＜0．05；特异性分别为94．4％和77．7％，P＜0．05。结论 心肌肌钙蛋白I对于AMI诊断具有较高的敏感性和特异性，是一种心肌损伤的特异性标志物，具有较好的临床使用价值。     

人心肌肌钙蛋白IcDNA的克隆及分泌表达

克隆人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因全序列，并进行分泌表达。从人心肌组织提取总RNA，经逆转录得到cDNA第一链，以此为模板，PCR扩增目的条带，重新设计上游引物，用相同PCR程序完成点突变；突变后PCR产物克隆入Pfd5载体，并用PCR、SpeI XhoI双酶切、载体测序等方法鉴定；用ITPG诱导cTnI的表达。PCR扩增出630bp左右条带，Pfd5—cTnI融合表达载体用PCR、SpeI Xho1双酶切均可见630bp左右条带，测序结果与预期序列一致；诱导后培养基及细胞周质均检测到cTnI蛋白免疫原活性。人心肌肌钙蛋白I得到成功表达。     

心肌肌钙蛋白I在急性心肌损伤诊断中的临床应用研究

目的分析心肌肌钙蛋白I(c Tn-I)对于急性心肌损伤诊断的应用价值。方法从2011年3月至2014年8月于我院治疗的心肌损伤患者中选取241例,分别在其发病5、24、48 h时检测所有患者的c Tn-I水平,以采取静脉血,2 h内分离血清的方式对血清c Tn-I进行检测。结果在发病后的5 h时的检测结果显示,c Tn-I阳性204例,占84.65%,发病24 h时,阳性241例,占100.00%,发病48 h后,阳性181例,占75.10%。其中发病24 h的检测率为100.00%,显著高于发病5 h及发病48 h时(P均<0.05)。结论 c Tn-I对于急性心肌损伤具有较高诊断价值,可作为急性心肌损伤临床诊断指标,值得推广。     

急性心肌梗死患者血清心肌肌钙蛋白I异常变化与近期预后的关系

目的探讨急性心肌梗死（AMI）患者血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）异常变化与近期预后的关系。方法入选AMI患者46例,发病后分别于7、10、14d采血测定血清cTnI,将患者分为A组28例,血清cTnI变化符合AMI正常规律;B组18例,血清cTnI变化异常,延迟下降或下降后又升高,随诊3个月观察两组患者心血管事件的发生情况。结果B组患者的恶性心律失常、梗死后心绞痛、心力衰竭、死亡等心血管事件发生率明显高于A组。差异有统计学意义（P〈0．01）。结论AMI患者血清cTnI异常变化可预测近期不良心血管事件的发生。     

血清肌钙蛋白I和肌红蛋白联合检测在急性心肌梗死早期诊断中的价值

目的探讨心肌肌钙蛋白I（CTnI）、肌红蛋白（Mb）联合检测在急性心肌梗死（AMI）早期诊断中的的应用价值。方法采集56例AMI患者于胸痛发作0～4h、8h、12h、24h、48h、3d、5d和7d的血清,以及对照组48例的空腹血清同步进行cTnI与Mb的动态检测。结果AMI组血清cTnI、Mb的浓度均高于对照组（P〈0．01）。AMI患者的早期0～4hMb的灵敏度明显高于cTnI;而8h以后cTnI的灵敏度和准确度明显高于Mb。结论CTnI、Mb作为心肌损伤的早期标志物联合检测,可提高急性心肌梗死早期诊断的特异性和敏感性。     

心肌肌钙蛋白I和肌红蛋白对急性心肌梗死的诊断价值及预后评价

目的　探讨血清心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白 I(c Tn I)和肌红蛋白 (Mb)对急性心肌梗死 (AMI)的诊断价值及预后评价。方法　连续搜集了急性胸痛的患者 12 1例 ,其中 AMI患者 6 3例 ,非 AMI患者 5 8例 ,对上述病例进行血清 c Tn I、Mb和肌酸激酶同工酶 (CK- MB)测定 ,观察其变化规律 ,分组比较心脏事件发生率。结果　 AMI发病 6 h以内 ,Mb首先升高 ,敏感性达 87.1%。发病 18～ 2 4 h,c Tn I敏感性达 10 0 .0 % ,且于发病第 5日仍维持敏感性达 6 1.1%。入院即刻 Mb敏感性 92 .1% ,高于 c Tn I 5 5 .6 %和 CK- MB 5 7.1% ;Mb特异性82 .8% ,低于 c Tn I96 .7%。入院次日晨 c Tn I敏感性 96 .8% ,高于 Mb6 1.9%和 CK- MB77.8%。AMI患者入院即刻 c Tn I增高组与正常组心脏事件发生率分别为 2 2 .9%和 3.6 % (P<0 .0 5 ) ,校正基线特征等多变量因素后 ,c Tn I是 AMI患者发生心脏事件独立的危险性预测因子 ,OR值 1.171(P<0 .0 5 )。结论　 c Tn I联合 Mb是诊断AMI的良好指标 ,其灵敏性和特异性能得到最佳体现。c Tn I亦有助于中后期 AMI的诊断。c Tn I是 AMI患者发生心脏事件独立的危险性预测因子     

cTnI及hs-CRP在急性心肌梗死诊断中的临床价值

目的 分析心肌肌钙蛋白I（cTnI）及高敏C反应蛋白（hs—CRP）在急性心肌梗死诊断中的临床价值。方法 随机选取本院2013年1～12月收治的48例急性心肌梗死患者作为治疗组,同时选取同期到本院就诊的48例健康体检人员作为对照组,检测两组患者的cTnI及hs—CRP水平。结果 治疗组cTnI及hs—CRP水平显著高于对照组．差异有统计学意义（P〈0．05）。治疗组患者cTnI在4～8h升高,高峰在8-12h,72h后降低;hs-CRP不断升高,高峰在12～24h,72h后降低到正常水平。结论 联合检测cTnI及hs—CRP,对诊断急性心肌梗死具有较高的临床价值,值得临床推广应用。     

急性心肌梗死检测肌钙蛋白I的临床意义

目的:探检测心肌肌钙蛋白I在急性心肌梗死的临床诊断意义。方法:98例临床确诊急性心肌梗死患者,分别于2～6小时、6～12小时、12～24小时和1～3天、3～7天采集血样,检测心肌肌钙蛋白I的变化,并以体检正常健康人38例为对照组。结果:急性心肌梗死患者发病后2～6小时、6～12小时、12～24小时和1～3天、3～7天测定心肌肌钙蛋白I阳性率分别为78.6%、80.6%、98.0%、99.0%和95.9%,与正常对照组比较差异有极显著性(P<0.01)。结论:心肌肌钙蛋白I在诊断急性心肌梗死中具有较高的灵敏度,更宽的诊断时间及高度特异性。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

乌司他丁对心肌缺血再灌注损伤NO、TNF-a、cTnI浓度的影响

目的观察乌司他丁（ulinastatin,UTI）对心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）损伤NO、TNF-a、cTnI浓度的影响,研究其机制。方法将24只新西兰大白兔不拘雌雄随机分为假手术组（shame组）,I/R组和UTI组,每组8只。分别于缺血前、缺血30min、再灌注30min、再灌注120min等4个时间点抽动脉血送做分离血清测血清超氧化物岐化酶（superoxide dismutaseSOD）、丙二醛（malondialdehyde MDA）、一氧化氮（nitric oxide NO）、TNF-a、cTnI浓度。结果经30min缺血、120min再灌注后,UTI组与I/R组血清SOD、NO均下降,MDA、TNF-a、cTnI均升高。UTI组与I/R组比较,SOD、NO下降减少,MDA、TNF-a、cTnI升高减少,差异具有统计学意义（P〈0.O5）。结论 UTI可降低心肌缺血再灌注损伤SOD、NO的下降,减少MDA、TNF-a、cTnI的生成。其机制可能是通过增加内源性一氧化氮的含量,抑制肿瘤坏死因子表达,清除氧自由基,从而达到心肌细胞保护性效果。     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.     

心肌肌钙蛋白Ⅰ及心肌酶谱在诊断支原体肺炎合并心肌损伤中的临床价值

目的探讨心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)在支原体肺炎合并心肌损伤中的临床诊断价值。方法检测68例支原体肺炎(Mycoplasma-pneumoniae MP)患儿和20例正常对照儿童心肌肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)浓度,并将68例支原体肺炎患儿分为心脏病变组(A组)33例和无心脏病组(B组)35例,比较cTnI、CK-MB的敏感性和特异性。结果 MP组与对照组血清(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05),而血清cTnI、CK-MB浓度明显高于对照组(P<0.01)。在诊断支原体肺炎合并心肌损伤中cTnI的敏感度(84.85%)和特异度(82.86%)均高于CK-MB的敏感度(66.67%)和特异度(77.14%)。结论 cTnI、CK-MB为诊断支原体肺炎合并心肌损伤的特异性指标,但cTnI具有更高特异性和敏感性。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

ProZZ-EGFP融合蛋白基因在大肠杆菌中分泌表达条件的优化

目的优化大肠杆菌分泌表达ProZZ-EGFP融合蛋白基因的培养条件。方法采用摇瓶培养,在液体培养基中加入终浓度不同的蔗糖、Triton X-100和甘氨酸,诱导大肠杆菌周质腔内蛋白质“泄漏”到液体培养基中,利用ProZZ-EGFP浓度-荧光强度标准曲线快速检测培养基中目的蛋白质浓度。结果利用大肠杆菌HB101表达ProZZ-EGFP融合蛋白,在培养基中含有终浓度1%Triton X-100及1%甘氨酸,可使ProZZ-EGFP在培养液的分泌表达量提高6倍。结论仅在培养基中加入几种物质即可提高ProZZ-EGFP融合蛋白的分泌表达量,简单易行。