人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

人纤溶酶原K5基因的结构改造及其在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的 改造人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因,构建RGDRGD-liteK5融合表达质粒,并表达纯化所得RGDRGD-liteK5蛋白.方法 以入纤溶酶原K5 cDNA为模板,通过PCR得到RGDRGD-liteK5基因片段,并克隆到质粒pGEXl-λT中,构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5;在IPTG诱导下,观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况;利用亲合层析柱纯化表达产物,用Western blot分析鉴定表达产物.结果 PCR扩增得到274 bp的片段,并成功插入pGEX1-λT质粒;含重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,其分子量为36 kD;获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量约为10 kD的RGDRGD-liteK5蛋白;Western blot证实了表达产物的正确性.结论 成功地改造了人纤溶酶原K5基因,构建了重组融合表达质粒pGEX-RGDRGD-liteK5,并纯化了其表达产物.     

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。     

丙型肝炎病毒基因免疫重组真核表达质粒构建的初步研究

目的:利用真核表达载体pCDNA3.1(+)与HCV核心区基因重组,为进一步表达蛋白打基础。方法:首先从1例HCV感染者血清中用反转录-PCR法获得全长的核心区基因并测序,继而将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建重组体。结果:HCV核心区基因为HCV型,将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,分子量为22KD,表达量占菌体蛋白的8.7%。然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建了pCDNAHCVc191和pCD-NAHCVc-hIL2两种重组体。结论:pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体,尤其后者是核心区基因与人白介素-2基因融合,可引发更好的基因免疫效果。上述工作奠定了整个HCV基因免疫研究的基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)Cag致病岛(Cag-PAI)编码的Cag3(hp0522)基因重组质粒,转入大肠杆菌中表达,纯化重组蛋白.方法 以Hp 11637基因组为模板,应用PCR技术扩增Cag3基因片段,克隆至pGEM-T载体中测序,然后克隆到高效表达载体pET-28a(+)上,得到了重组表达载体pET-28a(+)-Cag3,转化表达宿主菌大肠埃希菌BL21;经IPTG诱导表达后,将大量表达的重组蛋白用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化;采用串联飞行时间质谱技术对Cag3-His融合蛋白进行鉴定.结果 成功克隆了Cag3基因.经SDS-PAGE分析,表达蛋白相对分子质量与预期大小一致;质谱检测到Cag3重组蛋白的表达.结论 成功构建了Cag3基因的原核表达载体pET-28a(+)-Cag3.     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

重组CD_(13)单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4细胞的靶向杀伤作用

目的:本研究应用基因工程技术方法,构建含重组编码CD13单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide,AGAP)融合蛋白基因的表达载体,并研究CD13-AGAP融合蛋白对CD13阳性白血病细胞NB4影响。方法:克隆东亚钳蝎活性肽AGAP的基因,插入真核表达载体pSecTag2/CD13/RFP,得到pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染293T细胞,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白,作用NB4细胞,CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期。结果:酶切及测序结果证实pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体构建成功,转染293T细胞后,RT-PCR和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达,并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP对血液肿瘤CD13阳性白血病细胞NB4有一定的生长抑制作用,并且使细胞周期G1期阻滞,S期减少。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2/CD13/AGAP,并在293T细胞中成功表达,进一步证实融合蛋白对CD13阳性白...     

TAT-BDNF载体构建及融合蛋白表达

目的构建重组表达载体TAT-BDNF,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白,为研究TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。方法经RT-PCR获得编码人BDNF的全基因序列,连接到原核表达载体pTAT上,得到重组表达载体pTAT-BDNF,转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-BDNF融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了TAT-BDNF融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白。结论为进一步研究TAT蛋白转导作用奠定了基础。     

乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

目的构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌,优化乳糖诱导表达条件,并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因,将该基因片段克隆到载体pET40b中,转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数,将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化,重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物,最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功,利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果,重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。