大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITC-BSI结合试验）。结果倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

一种改良的肺微血管内皮细胞培养方法

目的对目前常用的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法进行改良,以期建立较为容易获取纯化的小鼠PMVECs的方法。方法应用C57小鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养PMVECs,光镜观察细胞形态,Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原免疫细胞化学法鉴定培养的PMVECs,并比较改良培养方法与传统培养方法的优越性。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈类圆形或短梭形,形成单层后呈铺路石样排列,Ⅷ因子相关抗原和CD31荧光染色阳性,利用改良的培养方法培养的细胞生长较传统方法更加快速,分布更加均匀。结论改良的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,克服细胞生长缓慢、杂细胞容易污染等难题,是一种较为理想的培养方法。     

新生小鼠肺微血管内皮细胞的培养和抗原制备

目的:建立简单有效的新生小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的培养和抗原制备的方法.方法:用1 wk龄内BALB/c小鼠的肺组织进行PMVEC的原代培养并传代,通过倒置显微镜、免疫组织化学鉴定,并用冻融、煮沸、超声等方法比较制备抗原.结果:体外培养的新生小鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的铺路石样排列,并可见管腔形成,获得的血管内皮细胞纯度较高,第Ⅷ因子相关抗原(ⅧF-AS)和CD31表达阳性,成功建立了PMVEC的原代培养方法.通过几种方法比较出超声破碎法制备抗原方法简单浓度高.结论:PMVEC的原代培养方法简便、可靠,保持了血管内皮细胞的结构和功能,且运用超声破碎法获得纯度较高的抗原,为进一步研究PMVEC在抗肿瘤血管治疗中奠定了基础.     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

兔血管内皮细胞的培养及生物学特性

目的 为构建组织工程血管提供种子细胞.方法 兔麻醉取主动脉,采用酶消化法培养血管内皮细胞并传代,倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察和免疫组织化学鉴定.结果 培养出血管内皮细胞并传代,倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,扫描电镜显示“铺路石”样生长,透射电镜可见内皮细胞特征性W-P小体,免疫组织化学鉴定Ⅷ因子（＋）.结论 兔血管内皮细胞培养成功,本法可为组织工程血管的研究提供细胞来源.     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.     

大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养方法研究

目的探讨大鼠心脏微血管内皮细胞的原代培养技术,以获取纯化的大鼠心脏微血管内皮细胞。方法应用体质量80 g的雄性Wistar大鼠左心室的微血管内皮细胞进行原代培养并传代培养;通过倒置显微镜扫描观察其形态,同时对培养细胞采用免疫组织化学荧光染色法进行内皮表面因子(vWF)鉴定,并用Hoechst染色,于荧光倒置显微镜下观察。结果体外培养的大鼠微血管内皮细胞呈梭形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。采用Hoechst染色后,可见90%以上的细胞胞浆和核膜周围被染成红色,细胞核呈蓝色荧光;merge 3染色见细胞胞浆和核膜周围被染成黑色,细胞核呈蓝色;cy-3染色见细胞胞浆和核膜周围被激发出红色光。证明培养细胞为血管内皮细胞。结论通过改进的微血管内皮细胞分离方法培养获得的细胞,生长状态良好、纯度高,且能够稳定地传代培养。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法的改良。方法 采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论 本方法可获得纯度高,结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。