人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EM)异位子宫内膜细胞原代培养方法,并比较EM在位及异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态的差异。方法:采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态差异。结果:正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为91.67%、93.75%和75.00%。EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大。EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小,且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起。结论:注意取材方式,采用改良原代培养方法,可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率。EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构与正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有显著不同。     

子宫内膜异位症体外细胞模型的建立

目的从子宫内膜组织分离腺上皮细胞和间质细胞，建立子宫内膜异位症体外多细胞模型。方法收集子宫内膜异位症和其他良性疾病的在位子宫内膜，采用高浓度胶原酶消化法进行内膜细胞的原代培养，以及传代培养。观察两组细胞形态，SABC免疫细胞化学进行细胞鉴定，MTT法绘制两组细胞的生长曲线。结果高浓度胶原酶消化后，子宫内膜异位症组和对照组腺上皮细胞和间质细胞大部分在48h内都能贴壁；腺细胞平均生长时间为6周；间质细胞平均生长时间为15周。腺上皮细胞角蛋白（cytokeratin）免疫细胞化学染色呈阳性，渡形蛋白（vimentin）为阴性；间质细胞角蛋白染色为阴性，而波形蛋白为阳性。两组生长曲线接近。结论高浓度胶原酶消化法建立子宫内膜异位症体外多细胞模型简单、易行。子宫内膜异位症在位内膜细胞的形态、生长和正常内膜细胞无明显差异。可以用作研究子宫内膜异位症细胞基因型特征、及其他因素对异位内膜细胞的影响的模型。     

人子宫内膜间质细胞的体外培养

目的：建立分离培养符合实验要求的人在位及异位子宫内膜间质细胞的方法,为进一步探讨子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：胶原酶消化在位和异位内膜组织,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果：角蛋白、波形蛋白染色证实细胞纯度达95%以上。 结论：胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的人子宫内膜间质细胞,可以用于子宫内膜异位症发病机制、药物筛选等研究。     

子宫内膜异位症在位及异位内膜IGF-1及IGFBP-3的表达

目的:探讨子宫内膜异位症患者在位及异位内膜胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及胰岛素样因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达水平,并探讨IGF-1及IGFBP-3在子宫内膜异位症发病过程中的作用,为临床治疗子宫内膜异位症提供新的思路.方法:选择子宫内膜异位症患者共64例(内异症组),另选择同期入院的非子宫内膜异位症患者54例作为对照(非内异症组),2组患者均经手术治疗,术毕分别取2组患者的内膜组织,经免疫组化、染色等步骤,制作好切片,在光镜下进行结果判定.结果:免疫组化结果显示,IGF-1在内异症患者的异位内膜间质细胞和腺上皮细胞均呈中度、强阳性表达,在内异症患者的在位内膜间质细胞(59例)及腺上皮细胞(62例)呈中度、强阳性;在非内异症患者子宫内膜间质细胞(48例)及腺上皮细胞(52例)呈阴性表达;IGFBP-3在内异症患者异位内膜间质细胞(62例)及腺上皮细胞(60例)呈阴性表达,在内异症患者在位内膜间质细胞(58例)及腺上皮细胞(52例)呈阴性表达,在非内异症患者子宫内膜间质细胞(51例)及腺上皮细胞(48例)呈强阳性表达.结论:IGF-1在子宫内膜异位症患者异位内膜及在位内膜均呈中度阳性及强阳性表达,在非内异症患者子宫内膜细胞则大部分呈阴性表达;而IGFBP-3在子宫内膜异位症患者异位内膜及在位内膜大多数均呈阴性表达,在非内异症患者子宫内膜细胞大多数呈阳性表达,推测IGF-1在子宫内膜异位症发病过程中起了一定的作用,而 IGFBP-3在对抗子宫内膜异位症的发生发展中有一定作用.     

人子宫内膜间质细胞原代培养及生物学行为的研究

目的探讨人子宫内膜间质细胞原代培养方法,并比较子宫内膜异位症(EMS)异位内膜间质细胞与正常子宫内膜间质细胞形态及生物学行为的差异,为EMS细胞模型的建立提供可靠依据。方法采用改良人子宫内膜间质细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜下观察细胞形态差异,采用CCK8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果正常子宫内膜间质细胞及EMS异位子宫内膜间质细胞分离培养成功率分别为93.33%、86.67%。两种间质细胞在生长速度、形态及生物学行为方面均具有明显差异。子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)比正常子宫内膜间质细胞(NSC)增殖旺盛,增殖48 h、72 h时ESC的细胞相对增殖率明显高于NSC,差异均有统计学意义(P48h0.001;P72h0.001)。24 h、48 h、96 h的NSC凋亡率明显高于ESC,差异均有统计学意义(P0.001)。72 h时,NSC、ESC凋亡率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论采用改良原代培养方法,可以明显提高人子宫内膜间质细胞培养成功率。体外细胞模型中异位内膜间质细胞的生长特性与子宫内膜异位症的疾病特点是一致的,可以成为疾病细胞机制研究的理想模型。     

子宫内膜间质细胞体外培养模型的建立

目的：探索在位子宫内膜间质细胞体外分离、纯化、培养的方法,从而建立研究子宫内膜异位症（EMs）的体外细胞模型。方法：选择因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫（次）全切除术的病例38例,术中取其子宫内膜,通过酶解、过滤、贴壁纯化等技术,分离培养子宫内膜间质细胞并进行传代。结果：36例标本获得成功,分离纯化得到的子宫内膜间质细胞经角蛋白、波形蛋白染色证实纯度达95％以上,活性较强,可以有限传代,传代培养的细胞形态特征与原代细胞一致。结论：该方法可以高效简便地分离在位子宫内膜间质细胞,得到的间质细胞产量及纯度高,可以作为 EMs 的体外细胞模型之一。     

性腺激素释放激素激动剂对子宫内膜异位症在位及异位内膜细胞凋亡的影响

目的 分析子宫内膜异位症在位及异位内膜细胞凋亡受到性腺激素释放激素激动剂的影响.方法 以30例子宫内膜异位症患者为研究对象,均给予体外培养,并利用不同浓度的性腺激素释放激素激动剂处理在位细胞和异位细胞,观察细胞生长及细胞凋亡受到性腺激素释放激素激动剂的影响情况.结果 子宫内膜异位症在位细胞核异位细胞生长率与性腺激素释放激素激动剂浓度及作用时间呈反比.性腺激素释放激素激动剂作用24 h后,高浓度在位、异位细胞凋亡率均高于低浓度,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 子宫内膜异位症在位及异位内膜细胞在性腺激素释放激素激动剂作用下加速凋亡,可促进患者康复.     

GnRHa对离体培养异位、在位内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响

目的 研究GnRHa对子宫内膜异位症(简称内异症)患者离体培养异住、在位子宫内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响.方法 体外原代培养人内异症异位、在位子宫内膜间质细胞,用10-10M、10-8和10-6M的GnRHa分别干预,用MTT法测定内膜间质细胞的生长增殖情况;用ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化.结果 GnRHa可抑制内异症异位及在位内膜间质细胞的生长增殖,呈剂量和时间依赖性(P<0.05).且对异位内膜问质细胞生长的抑制率明显高于在位(P<0.05);GnRHa可降低异位及在位内膜间质细胞分泌的VEGF的浓度,呈剂量依赖性(P<0.05),且高浓度(10-6M)对异位强于在位(P<0.05).结论 GnRHa可明显抑制子宫内膜异位症患者异住、在位子宫内膜间质细胞的生长,降低其分泌VEGF的浓度.     

子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测

目的 检测在位子宫内膜组织、子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）异位病灶组织及正常人子宫内膜组织分离提纯子宫内膜间质细胞及相应间质细胞中纤维化相关蛋白表达水平及差异。方法 在严格无菌条件下,刮勺刮取新鲜子宫内膜组织,冰盒运输,采用改良EMs原代细胞培养方法分离培养。并通过细胞爬片免疫组织化学方法,对分离提纯的细胞进行鉴定。蛋白免疫印迹方法检测对比分离提纯的细胞与相应组织纤维化相关蛋白表达的差异。结果 EMs在位内膜组织间质细胞原代分离12例均成功,成功率100%（成功指标：指细胞在培养瓶中贴壁生长并稳定传代）。EMs异位组织分离培养12例成功11例,成功率为91.7%。正常人子宫内膜组织分离9例成功8例,成功率为88.9%。人子宫内膜异位症异位间质细胞（human ectopic endometrial stromal cells,HEcESCs）与人子宫内膜异位症在位间质细胞（human eutopic endometrial stromal cells,HEuESCs）及正常人在位子宫内膜间质细胞（human normal endometrial stromal cells,HEnESCs）普通光镜观察无明显差异。但免疫组织化学、蛋白免疫印迹结果表明：HEcESCs纤维化相关蛋白的表达水平明显高于HEuESCs及HEnESCs两者纤维化相关蛋白表达水平（P<0.01）,而HEuESCs与HEnESCs纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）,各间质细胞纤维化相关蛋白的表达与其相应组织水平相一致。结论 采用改良EMs间质细胞原代培养方法,可以降低EMs子宫内膜间质细胞培养难度,并保持较高的细胞培养成功率。HEcESCs较HEuESCs及HEnESCs纤维化相关蛋白表达明显增高,即子宫内膜异位症患者,异位病灶在组织水平出现了明确的纤维化。     

GnRH Ⅱ与GnRH Ⅰ对子宫内膜异位症患者间质细胞分泌VEGF作用的比较

目的:测定GnRH Ⅱ与GnRH Ⅰ对子宫内膜异位症(Ems)患者离体培养子宫内膜间质细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨GnRH Ⅱ对Ems患者可能的作用.方法:给予原代培养的Ems患者在位及异位子宫内膜间质细胞不同浓度的GnRH Ⅱ,GnRH Ⅰ类似物(戈舍瑞林,goserelin)处理,同时设对照组(不加GnRH),采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养液中VEGF浓度,并进行比较.结果:Ems患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞经48 h培养,能分泌VEGF,分泌量与在位子宫内膜间质细胞的相近,两者比较差异无统计学意义(P＞0.05).不同浓度的GnRH Ⅱ对Ems患者离体培养的在位和异位子宫内膜间质细胞VEGF的分泌有明显的抑制作用,呈剂量依赖性(P＜0.05),且较GnRH Ⅰ类似物(戈舍瑞林)的作用更强(P＜0.05).不同浓度的GnRH Ⅱ对Ems患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞VEGF分泌的抑制作用明显强于在位(P＜0.05).结论:Ems患者的异位子宫内膜间质细胞具有分泌VEGF的功能,分泌量与在位子宫内膜的相近,这对Ems的形成和发展可能起重要作用.GnRH Ⅱ呈剂量依赖性地抑制异位内膜间质细胞分泌VEGF,其抑制作用明显强于在位,且GnRH Ⅱ明显强于GnRH Ⅰ,为寻找Ems抗血管形成方面的新药治疗提供了新的依据.     

GnRH II与GnRH I对子宫内膜异位症患者间质细胞 分泌VEGF作用的比较

目的：测定GnRH II与GnRH I对子宫内膜异位症（EMs）患者离体培养子宫内膜间质细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响,探讨GnRH II对EMs患者可能的作用。方法：给予原代培养的EMs患者在位及异位子宫内膜间质细胞不同浓度的GnRH II,GnRH I类似物（戈舍瑞林,goserelin）处理,同时设对照组（不加GnRH）,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养液中VEGF浓度,并进行比较。结果：EMs患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞经48 h培养,能分泌VEGF,分泌量与在位子宫内膜间质细胞的相近,两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同浓度的GnRH II对EMs患者离体培养的在位和异位子宫内膜间质细胞VEGF的分泌有明显的抑制作用,呈剂量依赖性（P＜0.05）,且较GnRH I类似物（戈舍瑞林）的作用更强（P＜0.05）。不同浓度的GnRH II对EMs患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞VEGF分泌的抑制作用明显强于在位（P＜0.05）。结论：EMs患者的异位子宫内膜间质细胞具有分泌VEGF的功能,分泌量与在位子宫内膜的相近,这对EMs的形成和发展可能起重要作用。GnRH II呈剂量依赖性地抑制异位内膜间质细胞分泌VEGF,其抑制作用明显强于在位,且GnRH II明显强于GnRH I,为寻找EMs抗血管形成方面的新药治疗提供了新的依据。     

EGR-1及MMP-9在子宫内膜异位症中的表达及意义

目的 研究早期生长反应基因-1(EGR-1)与金属基质蛋白酶-9(MMP-9)在子宫内膜异位症患者异位内膜与在位内膜细胞中的表达情况及临床意义.方法 收集45例2014年5月至2015年3月于四川省自贡市妇幼保健院确诊的子宫内膜异位症患者的异位内膜及在位内膜,同期收集30例非子宫内膜异位症患者的正常内膜组织.通过免疫组化二步法对三种内膜组织中EGR-1、MMP-9的表达情况进行分析.结果 EGR-1在子宫内膜异位症患者异位内膜(84.44%)与在位内膜(73.33%)腺上皮细胞中的阳性检测率显著高于正常内膜组(40.0%),差异有统计学意义(P<0.05),但两者差异无统计学意义(P>0.05);而不同内膜间质细胞中EGR-1的阳性检出率异位内膜为48.89%,在位内膜为44.44%,正常内膜为43.33%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);异位内膜和在位内膜腺上皮细胞(在位内膜88.89%、异位内膜64.44%)及间质细胞(在位内膜66.67%、异位内膜42.22%)中MMP-9的阳性检出率均显著高于正常内膜组(腺上皮细胞33.33%、间质细胞16.67%),差异均有显著统计学意义(P<0.01),且异位内膜组显著高于在位内膜组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 检测EGR-1、MMP-9的表达可用于判断子宫内膜异位症的侵袭转移和评估预后.     

子宫腺肌病原代内膜间质细胞培养及功能学鉴定

目的分离提纯培养子宫腺肌病(AM)内膜间质细胞(ESc),检测其细胞功能的差异,为进一步的细胞及分子水平研究奠定基础。方法选取2013年1月至2016年12月份在本院治疗的正常子宫内膜和子宫腺肌病手术病例,在严格无菌条件下,收集临床确诊的AM患者在位子宫内膜组织12例、异位子宫内膜组织41例及正常对照内膜组织13例,分别分离培养ESc,并通过免疫组织化学法对分离提纯培养的细胞进行鉴定。分别检测三种细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞功能。结果正常人ESc 13例,AM患者在位12例、异位ESc原代分离41例均成功,成功率为100.00%。与正常在位ESc相比,在位、异位ESc在普通光镜下,形态观察无明显差异,但是细胞功能方面,在位ESc生长曲线显示增殖率明显升高;异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,差异有统计学意义(P0.01),三种细胞凋亡无明显差异。结论采用间质细胞原代培养方法可以成功培养AM ESc,并保持较高的细胞培养成功率。在位ESc增殖率最高,异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,细胞凋亡均无明显差异。     

血管内皮生长因子在子宫内膜异位症中的表达及临床意义

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）在子宫内膜异位症（EMs）发生、发展中的作用。方法：应用免疫组化二步法检测EMs患者异位内膜36例、在位内膜36例及正常内膜中VEGF的表达情况,并对三组的VEGF表达水平进行相关性分析。结果：VEGF阳性表达主要见于子宫内膜间质血管内皮细胞和腺上皮细胞的胞浆。正常内膜组和在位内膜组中,VEGF的表达强度以阴性为主,仅少量阳性表达。异位内膜组中,VEGF的表达强度以＋＋～＋＋＋为主,阳言表达率91.7%,显著高于在位内膜组（25.0%）、正常内膜组（15.0%）,差异有统计学意义（P〈0.05）;而在位内膜组与正常内膜组VEGF阳性表达率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：异位内膜中存在VEGF的高表达,可能导致了血管生成,利于种植及生长,更易发生远处部位的种植转移。检测VEGF的表达可用于判断子宫内膜异位症的侵袭转移和评估预后。     

尿激酶型纤溶酶原激活物在子宫内膜异位症中的表达及意义

目的：研究尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）在子宫内膜异位症（EMs）组织中的表达及意义。方法分别采用免疫组织化学 SP 法及 RT‐PCR 法检测正常子宫内膜组织30例,EMs 的在位内膜35例,EMs 的异位内膜35例,uPA 蛋白及 mRNA的表达。结果 uPA 蛋白主要定位于子宫内膜腺上皮细胞与间质细胞的细胞质中,极少数表达于血管内皮细胞中,在 EMs 异位内膜中的表达强于在位内膜、正常内膜,在 EMs 在位内膜中的表达强于正常内膜（P ＜0．05）。 uPA 蛋白在3组内膜的增生期与分泌期中的表达差异无统计学意义（P＞0．05）。 uPA mRNA 在 EMs 患者异位内膜中的相对表达量高于在位内膜和正常内膜,在内异症在位内膜中的表达高于正常内膜（P＜0．05）。结论 uPA 可能在 EMs 异位内膜的黏附、生长等方面起一定作用。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．