cAMP反应元析结合蛋白在药物依赖形成中的作用

反复应用成瘾性药物引起中枢神经系统特定部位ｃＡＭＰ信号系统出现适应性改变,ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＣＲＥＢ）是受ｃＡＭＰ调节的主要转录因子,在动物产生药物依赖时脑内ＣＲＥＢ含量及磷酸化程度发生变化,与动物躯体依赖和精神依赖有关。确定ＣＥＲＢ在药物依赖中的作用有益于阐明药物依赖分子机制及采取相应的防治措施。     

cAMP反应元件结合蛋白与吗啡依赖

药物依赖具有下列临床特征 :（１）反复多次使用依赖性药物特别是阿片类药物后 ,可形成精神依赖性和躯体依赖性 ;（２）急性停药后 ,会产生一系列的戒断症状群 ;（３）停用依赖性药物后 ,相当长的一段时间内 ,存在稽延性戒断症状和药物渴求。由此可见 ,药物依赖是一种长时程的生物学效应 (ｌｏｎｇ-ｔｅｒｍｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｄａｐｔａｔｉｏｎ)。长时程生物学效应需要新的蛋白质或神经肽的合成。虽然药物依赖长时程适应性变化的机理较复杂 ,目前尚不十分清楚 ,但是 ,最近许多研究资料表明 ,胞核转录因子 -ｃＡＭＰ…     

cAMP反应元件结合蛋白与神经退行性疾病

cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response elem ent b ind-ing prote in,CREB)是位于细胞核内的转录因子。CREB的活性受到信号通路中许多因子的调控。CREB活化后与真核生物靶基因CRE序列结合并调节其转录,发挥多种生物学效应。在中枢神经系统,CREB调节着神经细胞生长发育,参与神经细胞突触可塑性、长时程记忆的形成过程。CREB参与阿尔采末病、血管性痴呆、亨廷顿舞蹈病及H IV-相关痴呆等神经退行性疾病的病理生理机制研究也取得了进展,成为以CREB作为靶点控制神经退行性疾病病程的理论基础。     

cAMP反应元件结合蛋白在LPS致肺微血管内皮细胞损伤过程中的作用

目的探讨cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cell,RPMVEC)炎症损伤过程中的作用。方法体外分离、培养RPMVEC基础上,Western blot法检测CREB磷酸化CREB水平,伊文思蓝-白蛋白法检测RPMVEC通透性。结果 LPS刺激RPMVEC后,CREB中Ser133位点磷酸化水平呈时间依赖性地增加,30 min时达到峰值,120 min仍未降至正常水平,加入10μmol·L-1V5681(PKA通路特异性抑制剂)共孵育后,CREB磷酸化几乎被完全抑制,RPMVEC单层通透性明显增加。结论 LPS能诱导RPMVEC中CREB快速磷酸化,PKA通路介导上述过程,CREB在LPS致RPMVEC炎症损伤过程中可能起到保护作用。     

缓激肽诱导胶质瘤细胞内cAMP反应元件结合蛋白磷酸化的实验研究

目的观察缓激肽作用下,大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element bind-ing protein,CREB)磷酸化的动态变化,并探讨其可能的意义。方法应用免疫细胞化学和Western blot方法,观察1μmol.L-1缓激肽作用C6胶质瘤细胞在不同时相点(0,5,10,15,20,30min)CREB磷酸化的动态变化。结果1μmol.L-1缓激肽作用C6胶质瘤细胞的5到30min的各时相点均能检测到CREB的磷酸化(P<0.01),其中以15min的磷酸化最强(P<0.01)。结论缓激肽可促进大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子CREB的磷酸化,此作用可能与其促进血肿瘤屏障的选择性开放有关。     

加味四逆散对皮质酮和谷氨酸致损伤的PC12细胞中cAMP反应元件结合蛋白及其磷酸化的影响

目的研究中药复方加味四逆散(JWSNS)对皮质酮和谷氨酸致损伤的PC12细胞中cAMP反应元件结合蛋白(CREB)及其磷酸化的影响。方法以200μmol.L-1Cort和50μmol.L-1Glu损伤的PC12细胞作为体外药理学研究模型,制备JWSNS含药血清,采用免疫组织化学法和West-ernblot法检测PC12细胞损伤模型中CREB和磷酸化CREB蛋白的表达。结果200μmol.L-1Cort和50μmol.L-1Glu可导致PC12细胞中CREB和p-CREB表达下降(CREB阳性细胞率分别为17.1%±4.2%和20.8%±5.7%,p-CREB表达量分别为0.587±0.123和0.515±0.157,P<0.05或P<0.01),10%JWSNS含药血清能升高CREB和p-CREB的表达(CREB阳性细胞率分别为62.6%±11.7%和79.5%±7.6%,p-CREB表达量分别为1.298±0.112和1.269±0.128,P<0.05或P<0.01)。结论10%JWSNS含药血清能通过调节cAMP-CREB信号通路发挥其神经保护和抗抑郁的作用。     

加味四逆散对皮质酮和谷氨酸致损伤的PCI2细胞中cAMP反应元件结合蛋白及其磷酸化的影响

目的研究中药复方加味四逆散（JWSNS）对皮质酮和谷氨酸致损伤的PCI2细胞中cAMP反应元件结合蛋白（CREB）及其磷酸化的影响。方法以200μmol&#183;L^-1Cort和50μmol&#183;L^-1Glu损伤的PC12细胞作为体外药理学研究模型,制备JWSNS含药血清,采用免疫组织化学法和Western blot法检测PC12细胞损伤模型中CREB和磷酸化CREB蛋白的表达。结果200μmol&#183;L^-1 Cort和50Ixmol&#183;L^-1 Glu可导致PCI2细胞中CREB和p-CREB表达下降（CREB阳性细胞率分别为17．1％&#177;4．2％和20．8％&#177;5．7％,p—CREB表达量分别为0．587&#177;0．123和0．515&#177;0．157,P＜0．05或P＜0．01）,10％JWSNS含药血清能升高CREB和P—CREB的表达（CREB阳性细胞率分别为62．6％&#177;11．7％和79．5％&#177;7．6％,p-CREB表达量分别为1．298&#177;0．112和1．269&#177;0．128,P＜0．05或P＜0．01）。结论10％JWSNS含药血清能通过调节cAMP—CREB信号通路发挥其神经保护和抗抑郁的作用。     

羟甲芬太尼立体异构体对培养的海马神经元cAMP-反应元件结合蛋白磷酸化的影响

AIM: To define the effects and signal pathways of ohmefentanyl stereoisomers [(-)-cis-(3R,4S,2'R) OMF (F9202),( )-cis-(3R,4S,2'S) OMF (F9204), and (-)-cis-(3S,4S,2'R) OMF (F9203)] on the phosphorylation of cAMP-re-sponse element binding protein (CREB) in cultured rat hippocampal neurons. METHODS: The effects of the three OMF stereoisomers and morphine (Mor) on cAMP accumulation and CREB phosphorylation were monitored by radioimmunoassay and Western blot analysis, respectively. RESULTS: The three OMF stereoisomers and Mor could all partially inhibit forskolin-stimulated (25μmol/L, 15min) cAMP accumulation in a dose-dependent manner and this effect could be reversed by naloxone. F9202, F9204, and Mor could significantly increase CREB phosphorylation from 2.88 to 3.59 folds over control levels after 30-min exposure. This effect was reversed by naloxone,but F9203 failed to increase CREB phosphorylation. KN-62 and staurosporine significantly blocked the opioidsinduced CREB phosphorylation, while H-89 and PD 98059 had no effect on the actions. CONCLUSION: Mor,F9202, and F9204, which could induce psychological dependence affected via the μ-opioid receptor, stimulated intracellular signal pathways involving Ca^2 /calmodulin-dependent protein kinases (CCDPK) and protein kinase C(PKC) pathways, which in turn initiated CREB phosphorylation. F9203, which could not induce dependence, had no effect on CREB phosphorylation in hippocampal neurons. The increased CREB phosphorylation in hippocampal neurons may play a role in opioids dependence.     

microRNA-132和Mecp2在甲基苯丙胺依赖中的作用

目的探讨miRNA-132及相关蛋白Mecp2、CREB在甲基苯丙胺(methamphetamine, MA)神经毒性中的作用。方法大鼠腹腔注射MA(10 mg·kg^-1·d^-1)建立1、2、4周3个不同依赖时程的MA依赖模型。取额叶皮质、海马,RT-qPCR检测miRNA-132、Mecp2 mRNA,Western blot检测Mecp2、p-Mecp2、CREB和p-CREB。结果在额叶皮质,miRNA-132、Mecp2 mRNA在MA依赖1、2、4周组表达均升高(P<0.05和P<0.01),Mecp2表达明显降低(P<0.01),Mecp2磷酸化水平则明显升高。在海马,miRNA-132呈降低趋势,在2、4周组明显降低(P<0.01);Mecp2 mRNA表达则明显升高(P<0.01);Mecp2在1周组表达升高(P<0.05),之后呈降低趋势,在4周组表达明显降低(P<0.05);Mecp2磷酸化水平在1周组降低(P<0.01),之后呈升高趋势,在2周组明显升高(P<0.01)。结论 MA可诱导miRNA-132异常表达。在额叶皮质,miRNA-132可能通过抑制mRNA的翻译,致Mecp2表达降低而发挥作用;但在海马,miRNA-132与Mecp2表达趋势未呈现反向对应关系,miRNA-132调节并不依赖于Mecp2。     

镧对大鼠海马CA1区环磷酸腺苷应答元件结合蛋白磷酸化的影响

目的探讨镧的神经毒性作用机制。方法 40只Wistar孕大鼠通过自由饮水的方式随机分为正常对照组,LaCl30.25%,0.5%和1.0%染毒组。染毒组仔鼠在断乳前通过母乳染毒,断乳后通过自由饮水的方式染毒1个月。电感耦合等离子体质谱法检测海马CA1区镧含量;磷酸二酯酶法检测海马CA1区钙调蛋白(CaM)活性;Western印迹法检测磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(p-CaMKⅣ),磷酸化环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(p-CREB)和c-jun蛋白表达;RT-PCR法检测c-jun mRNA表达水平。结果与正常对照组相比,LaCl30.25%,0.5%和1.0%染毒组海马CA1区镧含量显著高于正常对照组,分别为正常对照组的7.3,12.0和20.0倍(P<0.05);海马CA1区CaM活性显著降低,分别为正常对照组的80.7%,59.9%和30.6%(P<0.05);海马CA1区p-CaMKⅣ表达降低,分别为正常对照组的83.0%,57.4%和27.7%(P<0.05),p-CREB表达显著降低,分别降低了24.4%,36.6%和73.2%(P<0.05),c-jun蛋白表达显著降低,分别降低了36.1%,45.9%和83.6%(P<0.05),c-jun mRNA表达显著降低,分别降低了14.8%,27.2%和76.5%(P<0.05)。结论镧可能与钙竞争结合于CaM,造成海马CA1区CaM活性和CaMKⅣ,CREB磷酸化以及c-jun基因转录和蛋白表达水平下降,从而损害大鼠的学习记忆能力。     

Changes of phosphorylation of cAMP response element binding protein in rat nucleus accumbens after chronic ethanol intake： naloxone reversal

目的:研究慢性酒精摄取和戒断后大鼠伏核内cAMP反应元件结合蛋白(CREB)表达和磷酸化的变化。方法:给大鼠饮用含低浓度乙醇的水溶液(6％,v/v)1个月,采用免疫组织化学的方法检测大鼠伏核内CREB和p-CREB蛋白表达。结果:给大鼠长期饮酒显著降低伏核组织内p-cREB蛋白含量(-75％),撤除酒精24h、72h后伏核内p-cREB蛋白含量仍较低,与对照组比分别降低35％和28％;戒断7d后恢复到正常水平,但慢性酒精摄取和戒断不改变伏核内CREB蛋白含量,单独应用纳洛酮对大鼠伏核组织内CREB和p-CREB含量亦无影响,然而,当纳洛酮与酒精同时应用时,能拮抗酒精摄取大鼠伏核内p-CREB含量的下降(142％)。结论:长期酒精摄取降低伏核组织内CREB磷酸化,此作用可被纳洛酮翻转,这可能是酒精依赖形成的分子机制之一。     

行为敏化动物模型在药物依赖性评价中的应用

药物滥用和成瘾呈上升趋势。它既是一个严重的社会问题 ,又是一个非常重要的医学问题。因此 ,对作用于中枢神经系统的药物进行依赖性评价具有十分重要的意义。研究资料表明药物敏化与药物滥用和成瘾具有密切的关系 ,依赖性药物致敏化的药理学特性越来越受到重视。本文介绍了行为敏化动物模型建立的方法 ,阐述了行为敏化形成和表达的神经生物学机制 ,着重探讨了行为敏化动物模型在药物依赖性评价中的作用。     

Effects of ohmefentanyl stereoisomers on phosphorylation of cAMP-response element binding protein in cultured rat hippocampal neurons

AIM: To define the effects and signal pathways of ohmefentanyl stereoisomers [(-)-cis-(3R,4S,2'R) OMF (F9202), (+)-cis-(3R,4S,2'S) OMF (F9204), and (-)-cis-(3S,4S,2'R) OMF (F9203)] on the phosphorylation of cAMP-response element binding protein (CREB) in cultured rat hippocampal neurons. METHODS: The effects of the three OMF stereoisomers and morphine (Mor) on cAMP accumulation and CREB phosphorylation were monitored by radioimmunoassay and Western blot analysis, respectively. RESULTS: The three OMF stereoisomers and Mor could all partially inhibit forskolin-stimulated (25μmol/L, 15min) cAMP accumulation in a dose-dependent manner and this effect could be reversed by naloxone. F9202, F9204, and Mor could significantly increase CREB phosphorylation from 2.88 to 3.59 folds over control levels after 30-min exposure. This effect was reversed by naloxone, but F9203 failed to increase CREB phosphorylation. KN-62 and staurosporine significantly blocked the opioidsinduced CREB phosphorylation, while H-89 and P     

基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立

目的建立基于抗氧化反应元件(antioxident responseelement,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物。方法构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响。结果在加入25μmol.L-1H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100μmol.L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用最强,金雀异黄素诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25μmol.L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用最强,茨非醇诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.5倍。结论利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物。