单克隆抗体免疫亲和层析法制备缺凝血因子Ⅸ人基质血浆的初步报告

本文报告在 Mg~(++)存在下,将一种能特异地连接凝血因子Ⅸ的单克隆抗体偶联至 Affi-Gell5凝胶上,组成亲和层析柱,新鲜血浆通过该柱时, 唯独因子Ⅸ被吸附,流出液即为成品,以此制备缺因子Ⅸ基质血浆。成品内残余的因子Ⅸ极少(<1%),而其他凝血因子的活性基本末变。分别用本成品和重症乙型血友病病人血浆测定因子Ⅸ活性,再将两者的结果进行比较,相关系数 r=0.93(n=26),表明本成品可作为重症乙型血友病病人血浆之代用品。本法制备缺因子Ⅸ基质血浆快速、简便,仅需一步即可完成。     

凝血因子Ⅸ的研究进展

本文综述了凝血因子Ⅸ(F Ⅸ)的结构与激活、基因多态性和突变、F Ⅸ抗原和活性检测、F Ⅸ基因突变检测以及血友病B基因治疗的研究进展。     

凝血因子Ⅸ的研究进展

本文综述了凝血因子Ⅸ的结构与激活，基因多态性和突变，ＦⅨ抗原和活性检测，ＦⅨ基因突变检测以及血友病Ｂ基因治疗的研究进展。     

缺凝血因子Ⅶ血浆的研制及初步性能评价

目的制备缺凝血因子Ⅶ血浆(FⅦDP)并初步评价该FⅦDP的性能。方法利用本实验室建立的抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体(FⅦMcAb)杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生腹水法和亲和层析法制备高亲和力的FⅦMcAb,并将其偶联至CNBr-Activated Sepharose 4B上,制成FⅦMcAb免疫亲和层析柱,制备FⅦDP;采用凝血一期法检测自制FⅦDP中各凝血因子促凝活性并考察自制FⅦDP的精密度,对比自制FⅦDP和同类进口FⅦDP制品的测定线性范围、比较二者检测不同FⅦ水平样品的效果。结果所制备的FⅦMcAb亚类均被鉴定为IgG1型,利用该FⅦMcAb制备的FⅦDP中FⅦ促凝活性(FⅦ∶C)<1%,而FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C及FⅩ∶C都>70%,均满足正常凝血所需水平;该FⅦDP线性范围在1.625%—200%,3批次自制FⅦDP批内精密度(Sr)分别为3.30、3.36和3.30,批内变异系数分别为4.12%,4.11%,3.98%;批间精密度(Srr)4.20,批间变异系数4.99%,标准曲线的相关系数(r)分别为-0.998、-0.996和-0.996与同类进口制品(r=-0.998)基本一致;经相关分析,该FⅦDP对于不同FⅦ水平的样品的检测效果与同类进口产品一致,r分别为0.97、0.96和0.97。结论初步评价显示FⅦMcAb免疫亲和层析柱研制出FⅦDP性能良好,可作为FⅦ检测试剂使用。     

人高纯度凝血因子Ⅸ的研制

多年来凝血酶原复合物为乙型血友病主要治疗制剂，但有发生血栓性疾病和病毒性疾病之虞，需要一种高纯度，高安全性的因子Ⅸ制剂。我们建立了以人新鲜冰冻血浆为原料，用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ和Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ制备高纯度Ｆ Ⅸ纯度和比活分别为２０％和２８．１±９．６１Ｕ／ｍｇ（ｎ＝３），回收经４８％，纯化近３０００倍。我们用有机溶剂／介面活性剂对ＰＣＣ进行病毒灭活研究，使ＨＳＶ     

凝血因子Ⅸ纳米膜过滤条件的优化

目的提高纳米膜单位面积内凝血因子Ⅸ(FⅨ)的过滤量。方法采用正交试验设计方法,检验不同蛋白质浓度0.5、0.6、0.7 mg/m L FⅨ;温度4.0、15.0、25.0℃;预过滤膜类型:分别为Millipore(0.1μm、10 cm2),PALL(0.1μm、10 cm2),3M(0.1μm、10 cm2)对FⅨ过滤量的影响,记录2 h FⅨ过滤总量,分析比较过滤优化条件。结果0.7 mg/m L的FⅨ,25℃时,能使20 nm纳米膜的过滤载量由7.6㎏/m2提高至10.2㎏/m2。结论通过优化FⅨ浓度、过滤温度及滤膜类型等条件,可明显提高纳米膜对FⅨ的过滤载量,从而降低生产过程中纳滤膜过滤的成本。     

凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ浓缩物病毒安全性的临床评价

尽管献血者选择和血液筛选的方法已取得较大的进展,但单人份血液制品和大混合血浆制品仍有传播病毒的危险。因此,病毒感染被认为是采用凝血因子浓缩物进行替代治疗的血友病病人的并发症。在最近的10～15年里,血液制品厂家已开发出多种灭活病毒的方法,本文旨在对现行的各种灭活方法的病毒安全性的临床数据进行回顾和评价。     

病毒灭活血浆亚甲蓝及凝血因子的质量控制

亚甲蓝光化学法（MB-P）可消毒处理单袋新鲜冰冻人血浆,对经血液传播的主要病毒HIV、HBV和HCV等都具灭活作用,能显著提高临床输血的安全性,已在我国推广应用,但对于该法制备的病毒灭活血浆还缺乏系统规范的操作方法和质量控制标准,     

中国人凝血因子Ⅸ基因MseⅠ多态性

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和限制性内切酶ＭｓｅⅠ酶解分析，发现我国人群凝血因子ＩＸ（ＦｌＸ）基因５’侧翼－６９８位核苷酸存在ＭｓｅＩ多态性，该多态性由８３ｂｐ／５８ｂｐ＋２５ｂｐ组成。在受检的１１８个ＦＩＸ基因中，二者基因频率分别为０．６３５和０．３６５，多态性信息量为０．４６３。此系我国人群中发现的第二种限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ），有助于血友病乙携带者的检测及产前基因诊断。     

凝血因子Ⅷ、Ⅸ同时缺乏1例

凝血因子Ⅷ和Ⅸ(FⅧ：C、FⅨ：C)主要在肝脏中合成．参与机体内源性凝血机制。当FⅧ：C、FⅨ：C缺乏时会引起一系列出血症状。临床上常见单一的FⅧ：C或FⅨ：C缺乏．而两者同时缺乏极为罕见。近期笔者发现1例FⅧ：C、FⅨ：C同时缺乏患者。报告如下。     

人血源凝血因子Ⅸ纯化研究概况

凝血因子Ⅸ(FⅨ)是一种糖蛋白,与凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ同属维生素K依赖因子,分子量55000~65000D,在体内由肝细胞合成并分泌到血液中,健康人血浆中浓度约5μg/ml[1]。FⅨ在血液中以丝氨酸蛋白酶原的形式存在,经FⅪa或FⅦ和组织因子复合物激活后形成具有蛋白酶活性的活化FⅨ即FⅨa,参与凝血途径。人血液中凝血因子Ⅸ含量不足或缺乏会导致血友病乙(hemophilia B),又名乙型血友病。临床症状以自发性和轻微外伤后关节、肌肉和内脏出血难止为特征,大多数患者自幼有出血倾向,外伤或手术后渗血不止,渗血表现为皮下或肌肉血肿,关节腔反复出血导致肿…     

亲和层析法制备人凝血因子Ⅸ概述

血液凝固简称凝血．指血液由流动状态变为凝胶状态,是由一系列凝血因子参与的复杂的生理过程,是机体止血功能的重要组成部分。凝血因子Ⅸ（FⅨ）是一种单链糖蛋白,参与内源性凝血途径,在肝脏合成并依赖于维生素K。凝血因子Ⅸ缺乏或结构异常会使凝血活性降低,导致血友病B的发生,从而发生严重的凝血功能障碍。     

凝血因子Ⅸ促凝活性测定方法的条件选择

凝血因子Ⅸ促凝活性测定方法的条件选择６１００８１中国医学科学院输血研究所肖小璞，丁卫，李和，于，钟峻王海龄（指导）人血浆凝血因子Ⅸ促凝活性（ＦⅨ：Ｃ）的测定在出凝血疾病的诊断中具有重要的意义。过去在我国不能普遍开展一期法ＦⅨ：Ｃ检测，主要是难以得到缺...     

正常凝血质控血浆质量考察

目的考察自制冻干正常凝血质控血浆的性能。方法测定连续3批自制血浆各凝血因子活性等指标,以考察制备工艺的稳定性与可靠性;以活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和pH为测定指标,评价正常凝血质控血浆的批内均一性和稳定性;同时以新鲜混合血浆为对照,将自制产品与进口试剂进行比较。结果连续3批自制血浆的APTT、PT、TT均在正常值范围内,pH值稳定,各凝血因子的活性均>0.80IU/ml。变异系数APTT为0.6%(n=20),PT为0.8%(n=20),TT为2.2%(n=20)。血浆复溶后,4℃冰箱和室温下放置,8 h内血浆的APTT、PT、TT及pH均保持了较好的稳定性,其中变化最大的APTT极差为2.26s。冻干血浆4℃及-20℃存放条件下,30个月内血浆的APTT、PT、TT及pH亦保持了较好的稳定性,其中变化最大的APTT极差为3.29s。以新鲜混合血浆为对照,自制的正常凝血质控血浆与新鲜混合血浆其APTT均值相差0.52s,TT均值相差1.0s,PT无明显差别;德国DADE BEHRING正常凝血质控血浆与新鲜混合血浆其APTT均值相差6.82s,TT均值相差3.2 s,PT无明显差别。结论自制的正常凝血质控血浆具有正常凝血特性,产品的稳定性和批内均一性良好,可满足作为凝血试验质控血浆的要求。     

10例血友病B患者凝血因子Ⅸ基因突变分析

血友病B(HB)系凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺失、突变或重排所致的X染色体性连锁隐性遗传病,占血友病的11％ ～15％.男性发病率为1/30000,女性罕见[1].70％的患者有家族史,30％为散发病例,发病原因均为FⅨ基因突变[2].FⅨ基因序列于1982年被完整克隆[3],并于1985年完成测序[4].本研究我们采用PCR及基因测序技术对10例HB患者进行基因分析,初步探讨HB的分子机制,以期应用于HB家系中FⅨ基因携带者的诊断及产前诊断. 对象和方法 1.研究对象:2010年2月至2012年5月期间广西医科大学第一附属医院收治的10例男性HB患者纳入本研究.所有患者的诊断和分型均符合《血友病诊断与治疗中国专家共识》[5].进入本研究前患者均签署知情同意书. 2.标本采集、处理及DNA提取:采集10例患者外周静脉血,枸橼酸钠抗凝,检测APTT及FⅨ活性,12000 r/min离心(离心半径8 cm)2 min后,移除上清,保留沉淀并提取基因组DNA,DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品,按说明书操作,提取的DNA于保存于-20℃备用.     

血友病患者凝血因子Ⅷ、Ⅸ抑制物的发生率

凝血因子Ⅷ促凝剂(FⅦ:C)抑制物的产生是甲型血友病患者接受反复输血后发生的最严重并发症之一,据以往报道发生率约为3.6～25%。由于以往资料大多为回顾性分析,难以很好地反映出这种并发症发生的真实危险性。为估计这种并发症的年龄相关危险性及接受FⅧ的疗后FⅧ抑制物的发生率,了解纯化FⅧ制剂类型与抑制物形成的关系,作者进行了前瞻性研究。     

单克隆抗体免疫亲和层析法纯化人的凝血因子Ⅸ

本文报告一种对连接钙(或镁)离子的因子Ⅸ(FⅨ)之构型具有特异性的单克隆抗体(MAb),并将其偶联Affi-Gel 15凝胶,组成亲和层析柱.将钙(或镁)离子加入含有FⅨ的原料液内,混合液流进层析柱时,唯独FⅨ被吸附,而且易被不含钙(或镁)离子的缓冲液洗脱.如洗脱液内含1 mM EDTA,则FⅨ洗脱峰十分陡峭.1 ml凝胶能吸附0.1mg的FⅨ,其吸附容量是理论容量的8%.FⅨ制品比活性为140～180活性单位/mg蛋白.在还原和非还原的SDS-PAGE电泳图谱上呈现一条谱带.此方法快速,且仅需一步即可从人血浆内提取纯化10000倍的FⅨ.