CD74基因转染对内皮细胞特性的影响

目的探讨CD74基因在HUVEC的转染条件和CD74基因转染对细胞特性及功能的影响,为深入研究基于调节CD74表达的生物治疗打下基础。方法 （1）pCMV-CD74质粒转染前后ECV304细胞功能相关基因（HLA-A、HLA-DR、IFNGR）表达的检测：采用Real-time RT-PCR比较转染前后脐静脉内皮细胞各功能相关基因的表达;（2）应用Real-time RT-PCR分析软件分析实验数据。结果 Real-time RT-PCR结果显示,转染前后ECV304细胞HLA-A△Ct值分别为9.4881和12.1097,2-△△Ct为6.1543大于2,说明转染前后HLA-A表达有显著差异;IFNGR△Ct值分别为4.9828和5.5228,2-△△Ct为1.4539小于2,转染前后无显著差异;HLA-DR△Ct值分别为14.1098和14.7924,2-△△Ct为1.3036小于2,转染前后无显著差异。结论人脐静脉内皮细胞ECV304表达HLA-A、HLA-DR、IFNGR和CD74mRNA;pCMV-CD74转染可增加ECV304细胞CD74基因和膜分子的表达,增加HLA-A基因的表达,但不增加HLA-DR和IFNGR的表达,为深入探讨CD74基因与内皮细胞功能的相关性提供实验数据。     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的构建人CD40的真核表达载体,建立持续﹑稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后,再克隆到真核表达载体pCDNA3.1中,构建重组质粒pCDNA3.1( )/CD40,并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304,G418筛选转染的细胞。RT-PCR﹑Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果经酶切鉴定,重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实,重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达,流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95%。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1( )/CD40,并建立了高表达CD40的ECV-304,为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。     

TDL复合物提高人脐静脉内皮细胞基因转染效率的体外实验

目的 研究HIV-1 Tat蛋白转导域/质粒DNA/Liposome(TDL)复合物介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, pEGFP)在体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的转染效率.方法 将质粒DNA与Tat肽以不同的电荷比混匀,再加入2 μl Lipofectamine 2000制成TDL复合物.琼脂糖凝胶电泳分析质粒DNA与Tat肽的结合力;荧光显微镜和流式细胞仪观察TDL复合物与lipofectamine 2000介导基因在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果;MTT法检测TDL复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响.结果 TDL复合物组琼脂糖凝胶电泳未发现明显DNA条带.TDL复合物的转染率优于单用Lipofectamine 2000(P《0.05). Tat/DNA电荷比为8∶1时,TDL复合物的转染效率最高.TDL复合物组对细胞活性均无明显影响.结论 TDL复合物可明显提高基因在体外培养人脐静脉内皮细胞的转染效率,该方法可作为提高基因转染效率的有效手段之一.     

siRNA 对人脐静脉内皮细胞中人剪切修复基因表达和凋亡的影响

目的：向人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中导入靶向人剪切修复基因D干扰序列（XPD-siRNA）,观察其对HUVEC的XPD基因表达和凋亡的影响。方法以XPD为靶基因,构建3个特异性siRNA重组质粒,经转染后观察其对HUVEC中XPD的沉默作用;并转染沉默效率最佳的siRNA,观察其对细胞凋亡的影响。结果Western blot和RT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,3个重组质粒XPD-siRNA的转染均能降低HUVEC中XPD的表达（P＜0.01）,其中XPD-siRNA-2的沉默效率最高（P＜0.01）。流式细胞仪结果显示,与阴性对照组相比,XPD-siRNA-2组能降低HUVEC凋亡率（P＜0.01）。 Western blot结果显示,与阴性对照组相比,转染XPD-siRNA-2能下调Bax（P＜0.01）和上调Bcl-2（P＜0.01）的表达。结论 XPD-siRNA转染能有效沉默HUVEC中XPD基因的表达。所筛选沉默效率最佳的XPD-siRNA能抑制HUVEC凋亡,而Bax和Bcl-2可能参与了此过程。     

hVEGF121基因转染对人脐静脉内皮细胞生长的作用

目的:构建人血管内皮生长因子(hVEGF)-121的真核细胞复制表达质粒,将hVEGF121基因转染进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),通过旁分泌作用来加快其生长速度.方法:采用RT-PCR方法,从人胚胎成纤维细胞中克隆hVEGF121前体蛋白全长cDNA,构建重组真核表达质粒pcDNA3-hVEGF121,用FuGENE 6介导转染入HUVEC.收集转染的HUVEC培养上清,用ELISA法定量检测hVEGF蛋白的表达情况;绘制细胞生长曲线,检测hVEGF121促进HUVEC增殖的生物学活性.设转染pcDNA3空质粒载体和不转染任何DNA的HUVEC做对照.结果:(1)成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒,经测序证明基因序列与GenBank中核酸序列一致,且插入方向正确;(2)转染细胞瞬时表达hVEGF蛋白,于转染1d后每104个细胞每天可分泌hVEGF蛋白59.95 Pg,约为对照组的100倍;之后表达水平先快后慢下降,于转染7d后仍较对照组高近1倍;(3)转染细胞生长速度明显加快,在转染3 d后细胞数与对照组相比即有显著性差异(P＜0.01),细胞倍增时间从对照组的7d以上缩短为3d左右.结论:成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒;该质粒能在HUVEC中表达有生物活性的hVEGF121蛋白,通过旁分泌作用明显促进HUVEC的分裂增殖.     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。     

白细胞介素-6对人脐静脉内皮细胞前列环素合成的影响

目的 :探讨白细胞介素 - 6 (IL - 6 )对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)合成前列环素 (PGI2 )的影响以及钙拮抗剂、糖皮质激素对 IL - 6的作用的影响。方法 :采用培养的原代人脐静脉内皮细胞为实验对象 ,用放免法测定细胞培养液中的 6 - keto PGF1α。结果 :IL - 6组内皮细胞合成的 6 - keto PGF1α的量较对照组显著减少 ,对照组为 (6 2 0 .4±34 .1) pg/ ml,而 IL - 6组 (5 0 u/ m l、10 0 u/ ml)分别为 (5 0 3.2± 2 3.6 )、(470 .3± 2 3.6 ) pg/ m l(P <0 .0 5 ) ;钙拮抗剂可以拮抗 IL - 6的上述效应与 IL - 6组比较 ,P <0 .0 5 ,而地塞米松无此作用。结论 :IL - 6能抑制内皮细胞合成分泌PGI2 ,此作用可能是通过钙离子作为第二信使而实现的     

人脐静脉内皮细胞的研究和应用

血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点。其中使用最广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道。现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用。     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的:摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法:采用0.25%胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,用含20%FBS的DMEM培养基培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果:原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3～5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论:用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。     

抵抗素诱导脐静脉内皮细胞功能异常

 【目的】研究抵抗素（resistin）对脐静脉内皮细胞功能的影响，以探讨抵抗素在粥样硬化性疾病中的作用及其机制。【方法】原代培养人脐静脉内皮细胞，不同浓度人抵抗素（0、50、100ng／mL）培养24h。流式细胞检测抵抗素对内皮细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞间黏附分子（VCAM-1）与活性氧簇（ROS）表达的影响；RT-PCR检测抵抗素对内皮素（ET-1）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响。【结果】人脐静脉内皮细胞经人抵抗素（50ng／mL、100ng／mL）处理24h后ICAM-1和ET-1mRNA表达显著增高，而各组间VCAM-1表达、ROS生成，以及eNOS和iNOS mRNA表达无明显差别。【结论】抵抗素可通过增加ICAM-1表达，上调ET-1表达直接促进内皮细胞激活，提示脂肪细胞与内皮细胞的相互作用可能是动脉粥样硬化性疾病的发病因素之一。     

抵抗素诱导脐静脉内皮细胞功能异常

【目的】研究抵抗素（resistin）对脐静脉内皮细胞功能的影响，以探讨抵抗素在粥样硬化性疾病中的作用及其机制。【方法】原代培养人脐静脉内皮细胞，不同浓度人抵抗素（0、50、100ng／mL）培养24h。流式细胞检测抵抗素对内皮细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞间黏附分子（VCAM-1）与活性氧簇（ROS）表达的影响；RT-PCR检测抵抗素对内皮素（ET-1）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响。【结果】人脐静脉内皮细胞经人抵抗素（50ng／mL、100ng／mL）处理24h后ICAM-1和ET-1mRNA表达显著增高，而各组间VCAM-1表达、ROS生成，以及eNOS和iNOS mRNA表达无明显差别。【结论】抵抗素可通过增加ICAM-1表达，上调ET-1表达直接促进内皮细胞激活，提示脂肪细胞与内皮细胞的相互作用可能是动脉粥样硬化性疾病的发病因素之一。     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（Pg)对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖的影响，探讨Pg对牙龈血管内皮细胞的毒性作用。方法：以厌氧袋法培养Pg，原代培养HUVEC，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）观察HUVEC的增殖状态。结果：活的和灭活的Pg都剂量依赖性地抑制HUVEC的增殖，活的Pg作用比灭活的Pg更为强烈，而Pg毒力株W83和非毒力株ATCC33277对HUVEC增殖的影响无显著差异。结论：Pg可能通过损伤牙龈组织的血管内皮细胞加重局部的炎性反应，可能是Pg诱导牙周组织破坏的病理机制之一。     

不同浓度胰岛素对脐静脉内皮细胞形态和活性的影响

目的 观察不同浓度胰岛素对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)形态和细胞活性的影响,用以筛选内皮细胞胰岛素抵抗模型.方法 应用含不同浓度胰岛素(50,40,30,20,10,1,0.1,0.01U/L)的DMEM培养基与HUVEC共同培养6、12、2...     

镁对人脐静脉内皮细胞一氧化氮和一氧化氮合酶亚型的影响

目的：观察镁对人脐静脉内皮细胞一氧化氮（NO）和一氧化氮梧酶（NOS）不同亚型的影响。方法：镀铜镉还原法测定培养液中NO2^-/NO3^-含量，免疫组织化学法观察内皮细胞型NOS（eNOS)和诱导型NOS（iNOS)的表达。结果：与正常对照组相比，Mg^2 各剂量组NO2^-/NO2^-含量较高，差异具有显著性（P＜0．05）；H2O2＋Mg^2 各剂量组NO2^-/NO3^-含量高于H2O2组，差异具有显著性（P＜0．05）。与正常对照组相比，H2O2组iNOS和NF－κB P65平均灰度下降，eNOS平均灰度升高，且均具有显著性差异（P＜0．05），Mg^2 各剂量组eNOS平均灰度下降，具有显著性差异（P＜0．05）；与H2O2组相比，H2O2＋Mg^2 各剂量组iNOS和NF－κB P65平均灰度显著升高（P＜0．01），eNOS平均灰度下降（P＜0．05）；H2O2＋Mg^2 各剂量组eNOS和iNOS平均灰度低于相应的Mg^2 剂量组，且具有显著性差异（P＜0．05）。结论：镁的抗氧化作用机制可能涉及调控细胞转录因子和一氧化氮合酶不同亚型。     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的：摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法：采用0．25％胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,含20％FBSDMEM养基培养,待细胞80％融合后,以O．25％胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果：原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3－5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论：用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。     

新藤黄酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨新藤黄酸对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖和凋亡的影响。方法 用不同浓度的新藤黄酸培养细胞24、48 h后,采用MTT法观察新藤黄酸对细胞生长的抑制作用;倒置显微镜下观察HUVECs细胞形态变化;通过DAPI染色后倒置荧光显微镜观察新藤黄酸对细胞形态学的影响;通过Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测新藤黄酸对HUVECs细胞凋亡率的影响;Western blot检测新藤黄酸对HUVECs中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达变化。结果 MTT检测结果显示新藤黄酸能够明显抑制HUVECs的增殖,并呈时效及量效关系;荧光显微镜观察结果显示,新藤黄酸作用HUVECs后出现大量凋亡细胞;流式细胞术结果显示,与空白对照组相比,随着新藤黄酸浓度的增加,细胞凋亡率明显增加;Western blot检测结果表明Caspase-3蛋白表达水平显著增加。结论 新藤黄酸对HUVECs有明显的抑制作用,其作用机制可能是通过诱导细胞凋亡实现的。