反义寡核苷酸对高糖诱导的肾小管上皮细胞骨调素表达及Ⅲ型胶原分泌的影响

目的研究骨调素（OPN）反义寡核苷酸（AS-ODN）对高糖环境下人肾小管上皮细胞（HK-2）OPNmRNA和蛋白表达及Ⅲ型胶原分泌的影响。方法将HK-2细胞分为正常糖对照组、高糖组、渗透浓度对照组进行体外培养。用脂质体介导的方法将OPN反义、正义、错义寡核苷酸转染细胞,并进行高糖培养。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测OPN mRNA表达;流式细胞仪检测细胞内OPN蛋白合成;ELISA方法检测上清中Ⅲ型胶原分泌情况。结果高糖环境下,HK-2细胞OPN mRNA及蛋白表达明显升高（P〈0.01）,OPN反义寡核苷酸转染后,其OPN mRNA、蛋白表达及Ⅲ型胶原分泌均明显低于高糖组（P〈0.01）,而正义和错义的OPN寡核苷酸转染后与高糖组之间的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论体外培养的HK-2细胞经高糖诱导表达OPN,OPN反义寡核苷酸能够抑制OPN表达及Ⅲ型胶原分泌,表明阻断OPN可能是延缓高糖环境下肾小管上皮细胞细胞外基质积聚的有效手段之一。     

CTGF反义寡核苷酸对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸（ASODN）对人肾小管上皮细胞（HKC）转分化的影响。方法用巨噬细胞趋化因子-1（MCP-1）和马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）联合诱导HKC转分化模型。实验设空白对照组、模型对照组、PEI组、CTGFASODN10ng/mL组和CTGF ASODN100ng/mL组,分别采用WST-8法、流式细胞术、RT-PCR法、细胞免疫组织化学法检测不同浓度的CTGF ASODN对HKC转分化模型细胞增殖和细胞周期的影响,以及α-SMA mRNA表达和α-SMA、TGF-β1、Fibronectin（FN）蛋白表达的变化。结果 100ng/mL的CTGF ASODN对MCP-1和AAⅠ联合诱导HKC转分化细胞具有促进细胞增殖的作用,并可减少实验模型导致的细胞S期阻滞,降低α-SMA mRNA表达,减少α-SMA、TGF-β1和FN蛋白的表达。结论 CTGFASODN能够抑制MCP-1和AAⅠ导致的人HKC转分化。     

CTGF反义寡核苷酸对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的影响.方法 用巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)和马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)联合诱导HKC转分化模型.实验设空白对照组、模型对照组、PEI组、CTGF ASODN 10 ng/mL组和CTGF ASODN 100 ng/mL组,分别采用WST-8法、流式细胞术、RT-PCR法、细胞免疫组织化学法检测不同浓度的CTGF ASODN对HKC转分化模型细胞增殖和细胞周期的影响,以及α-SMA mRNA表达和α-SMA、TGF-β1、Fibronectin(FN)蛋白表达的变化.结果 100 ng/mL的CTGF ASODN对MCP-1和AAⅠ联合诱导HKC转分化细胞具有促进细胞增殖的作用,并可减少实验模型导致的细胞S期阻滞,降低α-SMA mRNA表达,减少α-SMA、TGF-β1和FN蛋白的表达.结论 CTGF ASODN能够抑制MCP-1和AAⅠ导致的人HKC转分化.     

CTGF反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞胶原Ⅲ分泌的影响

目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞NRK52E胶原Ⅲ分泌的影响。方法 采用脂质体介导的方法将CTGF反义寡核苷酸导入细胞，转化生长因子β1（TGF-β1）刺激48h后，用RT-PCR、ELISA法观察CTGF和胶原Ⅲ的表达。结果 TGF-β1能够诱导NRK52E细胞表达CTGF并进而促进胶原Ⅲ的分泌，CTGF反义寡核苷酸导入细胞后可以大部分取消TGF-β1，的作用，而对照组的寡核苷酸没有此作用。结论 CTGF反义寡核苷酸能够特异地抑制CTGF的表达，进而阻止细胞外基质的生成，这可能是治疗肾间质纤维化的一条新途径。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞转分化

目的探讨转化生长因子β-1(TGFβ1)诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程中结缔组织生长因子(CTGF)的表达和作用.方法在用MTT比色、荧光分析证明阳离子脂质体(DOTAP)介导CTGF反义寡核苷酸(AS)转染HKC可行的基础上,将培养的HKC分为4组正常对照组(C组);TGFβ1组(T组);TGFβ1加AS组(T+AS组);4、TGFβ1加CTGF错义寡核苷酸组(T+SC组).分组处理96h后,分别采用免疫组化、Western blot和RT-PCR技术检测各组CTGF、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并分析CTGF和α-SMA表达量的相关性.结果C组CTGF和α-SMA表达阴性;T组CTGF和α-SMA表达阳性;T+AS组CTGF和α-SMA表达阳性,但皆显著低于T组(P＜0.01)T+SC组CTGF和α-SMA表达皆和T组无显著差异(P＞0.05).相关分析CTGF和α-SMA在表达量上皆呈较强的线性相关性.结论CTGF的AS能有效地抑制TGFβ1所诱导的TEMT,提示CTGF是TGF β1诱导TEMT所必需的成份.     

反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞表达CTGF

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS)转染人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)后对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导CTGF表达的抑制作用.方法采用脂质体转染试剂DOTAP,包裹针对CTGF的反义寡核苷酸转染HKC.用MTT比色法检测DOTAP对细胞增殖的影响,用荧光显微镜和荧光分光光度计检测5′异硫氰酸荧光素(5′FITC)标记的AS在细胞内的分布,用RT-PCR和免疫组化分别检测TGFβ1和AS对CTGFmRNA和蛋白表达的影响.结果MTT比色:不同浓度(0、3.3、6.7、10μl/ml)的DOTAP对细胞增殖的影响无明显差异(P＞0.05).荧光检测:DOTAP能高效地介导AS转染入HKC.RT-PCR和免疫组化:浓度为40μg/ml的TGFβ1能诱导HKC表达CTGFmRNA和蛋白,同时加入DOTAP-AS复合物后(DOTAP浓度为6.7μl/ml,AS浓度为1μg/ml),CTGFmRNA和蛋白的表达明显下降(P＜0.01).结论DOTAP能高效低毒地把CTGF反义寡核苷酸转染入HKC,进而能有效地封闭TGFβ1所诱导的CTGF表达.     

腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用

目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础.     

高盐对SD大鼠肾脏骨调素mRNA表达的影响

OBJECTIVE: To investigate the effect of high-salt diet on the expression of osteopontin (OPN) mRNA and its protein in Sprague-Dawley rat kidney. METHODS: Forty-eight male SD rats aged 10 weeks receiving normal salt diet were enrolled in study, and were divided into two groups and fed with high salt diet (4%NaCl) or normal salt diet (0.6%NaCl) for 12 weeks respectively, with 24 rats in each group. Tail systolic blood pressure and bodyweight were measured in all rats every week. At the end of 4th, 8th and 12th week, 6 rats in each group were sacrificed for detection of the expression of OPN mRNA and its protein in the kidney with quantitatine real-time (QRT)-PCR and immunohistochemistry, respectively. RESULTS: No significant difference was found in blood pressure, bodyweight and kidney weight/bodyweight between high-salt diet group and normal salt diet group (P>0.05). The expression of OPN mRNA (0.27+/-0.16 vs 0.15+/-0.13, P<0.05) and its protein (0.78+/-0.15 vs 0.61+/-0.11, P<0.01) in SD rat kidney with high-salt diet were up-regulated at the end of 12th week compared with the rats with normal salt diet. CONCLUSIONS: High-salt diet increase the expression of OPN mRNA and its protein in SD rat kidney. Renal injury induced by high salt intake might be independent of blood pressure change.     

反义寡脱氧核苷酸及卵泡刺激素对卵巢黏液性囊腺癌细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察卵泡刺激素受体（FSHR）反义寡脱氧核苷酸（antisense ODN）及卵泡刺激素（FSH）对体外培养人卵巢黏液性囊腺癌（OMC）细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法 OMC细胞与不同浓度的FSH、antisense ODN和无义ODN（onnsensc ODN）共培育48、72h后．采用免疫细胞化学SP法检测细胞核内PCNA的表达。结果FSH明显增强PCNA的表达，而antiscnse ODN则显著降低PCNA的表达．与对照组比较．差异均有显著性意义（均P＜0．05或P＜0．01）；应用nonsensc,ODN未观察到其对PCNA表达的影响。同时．antisense ODN可明显拮抗FSH促PCNA表达增加的作用，差异有极显著性意义（P＜0．01）。结论 在OMC发展过程中，FSH具有一定的促进作用．antisense ODN可有效抑制癌细胞的增殖以及FSH的促增殖作用。     

ET-1AS-ODN对糖尿病大鼠心肌重构效应的保护作用

目的探讨内皮素-1反义脱氧寡核苷酸（ET-1AS-ODN）对链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠心肌重构效应的保护作用及其机制。方法一次性腹腔注射STZ（60mg.kg-1）,建立大鼠糖尿病模型,并观察ET-1AS-ODN预防性给药对大鼠糖尿病心肌重构效应的保护作用。结果实验动物饲养5周后,与生理盐水对照（NC）组相比,糖尿病模型组大鼠体重明显减轻（P〈0.05）,心肌细胞重构明显,表明糖尿病心肌病变（diabetic cardiomyopathy,DC）模型已构建;与DC组比较,ET-1AS-ODN各治疗组心脏指数和心室指数均减小;大鼠心肌VG染色观察仅见心肌细胞间有少量胶原纤维沉积,但大部分心肌纤维结构完整,横纹清楚。结论内皮素-1反义寡核苷酸可减轻STZ诱导的糖尿病大鼠的心肌重构效应,对心肌组织具有保护作用。其机制可能与ET-1 AS-ODN降低糖尿病大鼠内源性ET水平,减少胶原合成,从而改善心肌重构效应有关。     

hTERT反义寡核苷酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的探讨hTERT反义寡核苷酸抑制端粒酶活性对乳腺癌细胞增殖的影响。方法用脂质体介导反义寡核苷酸转染MCF-7乳腺癌细胞株,采用TRAP-ELISA法检测转染后细胞端粒酶的活性,观察其前后的变化。MTT法检测细胞活性,流式细胞仪观察细胞周期及细胞凋亡率变化。结果转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测到细胞凋亡峰,细胞阻滞于S期,正义寡核苷酸则无此作用。结论端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞的增殖,且具有促凋亡作用。     

硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响

目的探讨硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响。方法设计合成HBV5个硫代反义寡聚核苷酸(S-as ODN)靶序列。应用ELISA方法、MTT比色法、观察S-as ODN对HBsAg、HBeAg抗原表达及Hep G22215细胞毒性的影响。结果不同靶位点的S-as ODN对HBsAg、HBeAg表达都有显著的抑制作用,在浓度为20μmol／L时,对细胞无明显杀伤作用。结论S-as ODN对Hep G22215的HBsAg、HBeAg的抑制作用为抗HBV治疗提供了新的途径。     

β-catenin反义寡核苷酸对MCF-7细胞增殖和紫杉醇敏感性的影响

目的 探讨β-catenin反义寡核苷酸(ASODN)对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,及其与紫杉醇(paclitaxel)联合时对MCF-7细胞的抑制作用.方法 不同浓度的β-catenin ASODN和错义对照(SODN)作用于MCF-7细胞48 h后,测定细胞凋亡比例.以终浓度为10 μmol/L的ASODN、SODN和空白对照培养细胞10 d后,计算各自的集落形成率.按不同组合分别在培养细胞中加入ASODN、SODN、紫杉醇,于培养24、48 h用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测β-catenin mRNA 表达,培养72 h后MTT法计算各组细胞存活率.结果 MCF-7细胞凋亡比例随β-catenin ASODN作用浓度升高而略有升高,与SODN、空白对照组比较差异有显著性意义(均P<0.05).ASODN组平均集落形成率(12.5%)与SODN组(34.0%)和空白对照组(37.0%)差异有统计学意义(均P<0.05).MTT实验和荧光定量RT-PCR结果显示,ASODN联合紫杉醇组与单用ASODN组或单用紫杉醇组比较,细胞生长抑制率明显增高,β-catenin mRNA表达相对值明显降低,均存在显著性差异.结论 β-catenin ASODN抑制MCF-7细胞增殖,促进凋亡,并且同紫杉醇联合作用时显著抑制细胞生长和β-catenin mRNA 表达.     

Effects of Antisense Oligodeoxynucleotide to Follicle-stimulating Hormone Receptor on the Expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen and Vascular Endothelial Growth Factor in Primary Culture Cells Derived from Human Ovarian Mucinous Cystadenocarcino

The effects of antisense oligodeoxynucleotide (antisense ODN) to follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) and follicle-stimulating hormone (FSH) on the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were studied in primary culture cells derived from human ovarian mucinous cystadenocarcinoma (OMC). The prlmary OMC cells were cultured with the enzyme digestion method, and the expression of pan Keratin protein and FSHR mRNA was detected for identification of the cells. OMC cells were co-cultured with antisense ODN, nonsense ODN and FSH with different concentrations for 48 h and 72 h. The expression of PCNA and VEGF was detected by using SP immunohistochemistry. Compared with that in the control group, the PCNA and VEGF expression was increased obviously in FSH groups (P＜0.05 or P＜ 0.01), while decreased significantly in antisense ODN groups (P＜0. 05 or P＜0.01) and unchanged in nonsense ODN groups, respectively. Meanwhile, antisense ODN could antagonize the increased expression of PCNA and VEGF caused by FSH significantly (P＜0.01). It was suggested that FSH might promotethe development of OMC to some extent. Antisense ODN could inhibit the proliferative activity of OMC cells and the promoting proliferative activity enhanced by FSH.     

反义IL-6寡核苷酸对实验性系膜增生性肾炎IL-6、IL-6mRNA表达的影响

[目的]观察反义IL-6寡核苷酸经左肾动脉注入系膜增殖性肾小球肾炎SD大鼠后对肾小球系膜区IL-6 mRNA及蛋白水平的影响。[方法]30只SD大鼠接受葡萄球菌内毒素静脉注射、牛血清白蛋白隔日口服、完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂皮下注射,并加做肝左叶切除术,制作系膜增生性肾小球肾炎动物模型。经FAM标记的反义寡核苷酸肾小球定位后,将IL-6反义、正义、及错义寡核苷酸由左肾动脉注入肾脏,并用右肾作对照,分别作常规组织病理,免疫组织化学及原位杂交检测。[结果]FAM标记的IL-6反义寡核苷酸经左肾动脉注入后1h,系膜区可检测到少量表达,6 h后肾系膜区表达明显增加。反义寡核苷酸治疗组的SD大鼠IL-6。IL-6 mRNA表达被显著抑制(P<0.01),但IL-6正义及错义寡核苷酸对IL-6、IL-6 mRNA表达无明显影响(P>0.05)。3组蛋白尿及病理改变均无显著差异(P>0.05)。[结论]脂质体介导的反义寡核苷酸(IL-6)能在肾小球表达。IL-6反义寡核苷酸治疗显著抑制系膜增生性肾炎SD大鼠IL-6、IL-6 mRNA表达,但IL-6正义、及错义寡核苷酸无此作用。     

增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应

目的:探讨低浓度增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸(PCNA-ASODN)调节脐血造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应。方法:用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离出CD34 细胞,先后加入低浓度PCNA-ASODN作用于体外培养的CD34 细胞,用流式细胞仪检测培养后各种细胞的数量及细胞周期的变化。结果:实验组脐血CD34 造血前体细胞明显被扩增,但以第72 h组的扩增效应最为显著,其CD34 细胞比例增高[(35.6±1.8)%],而CD34 CD38-细胞数量扩增达(55.1±4.2)倍,且G0/G1期细胞占(49.8±2.5)%。结论:低浓度PCNA-ASODN对脐血CD34 造血前体细胞体外扩增的调节具有时间效应,同时能延缓扩增过程中伴随的细胞分化。     

A Novel Antisense Oligodeoxynucleotide Targeting Caspase-3 mRNA Prevents PC-12 Cell Apoptosis Induced by Aβ_(25-35)

Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓｄｉｓｅａｓｅ (ＡＤ) ,ａｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒ,ｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｎｅｕ ｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｂｙｎｅｕｒｏｔｉｃｐｌａｑｕｅ ,ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌ ｌａｒｙｔａｎｇｌｅｓ,ａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｎｅｕｒｏｎａｌｌｏｓｓ[1] .Ｎｅｕ ｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｓｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｏｆｎｅｕｒｏｎｓｌｏｓｓａｎｄｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＡＤ .Ｃａｓｐａｓｅｓａｒｅｒｅｓ…     

反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞生长的抑制作用

目的探讨反义c-myc寡核苷酸(ASODN)对半乳糖诱导的兔晶体上皮细胞(LEC)生长的影响.方法人工合成与c-myc基因第二外显子翻译起始区序列互补的寡核苷酸,用半乳糖和反义寡核苷酸处理培养的晶体上皮细胞,应用细胞计数法和MTT法观察反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞增殖的影响.结果 2.5～10.0 μmol/L反义c-myc寡核苷酸能抑制半乳糖诱导的晶体上皮细胞的增殖,10.0 μmol/L时作用较显著.结论反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的白内障晶体上皮细胞的生长增殖有抑制作用.