肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力蛋白NleB1的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定

目的：构建肠出血性大肠杆菌（ EHEC） O157∶H7毒力蛋白nleB1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备NleB1的抗血清。方法从EHEC O157∶H7 EDL933株的全基因组中PCR扩增出编码nleB1的990个碱基序列,构建原核表达载体pET24a-nleB1,将构建的重组表达载体的质粒pET24a-nleB1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白His-NleB1表达,并利用镍柱进行亲和层析纯化和切胶纯化,以纯化后的融合蛋白His-NleB1为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清。 Western印迹和ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建了pET24a-nleB1原核表达载体,纯化得到融合蛋白His-NleB1,进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western印迹和ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了EHEC O157∶H7的毒力蛋白NleB1的多克隆抗体,为研究EHEC O157∶H7毒力蛋白NleB1的功能奠定了基础。     

用Red系统敲除大肠杆菌O157:H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157:H7的突变体.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5'端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除.结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7突变菌株.结论:为进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。     

用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

CTB-mST2融合蛋白在大肠杆菌表达及其生物活性鉴定

目的:表达霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌突变的热稳定肠毒素(mST)的融合蛋白,并进行抗原性和免疫原性的分析.方法:通过连接肽(linker)将CTB基因和串连的mST连接,然后插入表达载体pET-22b( ),获得克隆,经IPTG诱导获得CTB-mST2融合蛋白.采用多因素正交优选法优化了培养基及培养条件,对表达产物进行包涵体复性后,经过亲合层析纯化得到融合蛋白,并对该融合蛋白抗原性和免疫原性进行了分析.结果与结论:构建了高效表达工程菌,经摇瓶培养,在优化培养基及培养条件下融合蛋白表达量可达320 mg/L,占总蛋白40%.融合蛋白免疫小鼠,可获得高滴度抗CTB和ST血清;将融合蛋白与灭活的O157∶ H7菌体组合免疫小鼠,可产生对O157∶ H7毒株攻击的保护力.本研究可为构建抗ETEC和EHEC复合疫苗提供依据.     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

PTD-NGF融合蛋白的制备、活性分析及其跨膜功能研究

目的:构建PTD-NGF融合基因,检测表达的重组蛋白生物学活性和跨膜转运功能.方法:提取小鼠大脑组织RNA逆转录后,钓取β-NGF基因.PCR技术构建PTD-NGF融合基因,插入表达质粒pBV220后,转化大肠杆菌DH5α进行表达与纯化.稀释法复性后,SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达重组蛋白.PC12细胞分化培养检测融合蛋白的生物学活性.重组蛋白与HepG2细胞共孵育,免疫组化检测其跨膜功能.结果:PTD-NGF融合基因测序正确,表达产物与目的蛋白大小相符,能与NGF抗体发生结合反应.纯化后蛋白纯度可约达90%以上,重组蛋白经复性可诱导PC12细胞出现明显分化,并能跨膜进入HepG2细胞内部.结论:成功构建了融合基因,表达的重组蛋白具有显著的生物学活性及跨膜转运功能.     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.