尖锐湿疣患者外周血及经体外诱生的HPV16抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞检测

目的 研究尖锐湿疣患者外周血HPV16抗原特异性CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)表型变化及正常人T细胞对病毒抗原肽体外刺激的细胞免疫应答反应在尖锐湿疣发病机制中的作用。方法 采用免疫荧光标染重组MHCⅠ类分子-多肽五聚体技术,流式细胞仪定量检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E7_11-20(HLA-A^*0201/YMLDLQPETF)抗原特异性CTL(Pent⁺CD8⁺)、活化CTL(Pent⁺CD8⁺CD69⁺)及记忆性CTL(Pent⁺D8⁺CD45RO⁺)数量。同时,用HPV16E7_11-20合成多肽、重组人白介素7、白介素2体外刺激13例正常人外周血单一核细胞产生抗原特异性CTL,并对其进行表型分析,以无关肽HBVcore_18-27作为阴性对照。结果 尖锐湿疣患者外周血CD8⁺T细胞中HPV16抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.76%±0.43%.0.36%±0.20%及0.33%±0.15%,对照组分别为0.24%±0.07%,0.17%±0.05%及0.15%±0.06%。两组比较,P值分别<0.01,<0.05及<0.01。病毒多肽体外刺激T细胞7d后,抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.75%±0.16%,0.35%±0.15%及0.33%±0.18%,均比非刺激组的0.24%±0.06%,0.16%±0.03%及0.13%±0.04%明显增多,P值均<0.01。结论 HPV感染诱导CD8⁺T细胞克隆性增殖,产生抗原特异性CD8⁺CTL,高效、特异性直接杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥作用。     

人乳头瘤病毒16 E7抗原细胞毒性T细胞预测表位合成肽的纯化与鉴定

人乳头瘤病毒(HPV)16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。本研究选用已预测出的HLA-A2限制性CTL表位^[1],采用固相合成法合成多肽,产物经反相高效液相(RP-HPLC)纯化、分析和质谱分析鉴定,所获取的高纯度肽为预测表位抗原性的检测奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒（HPV）16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA－A2分子结合的情况，推测成为HLA－A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟，确立各表位及其与HLA－A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现，各表位的三维结构符合HLA－A2限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位的结构要求，能较好地与HLA－A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持，各预测表位符合要求，提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。     

人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的：利用穿膜肽人免疫缺陷病毒（HIV）-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒（HPV）16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（第49～57位氦基酸）的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法：应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原（HLA）-A2．1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA—A2阳性健康者外周血单个核细胞（PBMC）中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果：经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95％以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性（P〈0．05）。结论：在HPV16E7HLA—A2．1限制性CTL表位（49～57）的N-末端加上HIV—Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。     

恶性黑素瘤细胞毒性T淋巴细胞治疗研究现状

在人类恶性肿瘤的免疫治疗中,对恶性黑素瘤的研究最为广泛深入。近年来的研究表明,人类恶性黑素瘤的肿瘤免疫主要是由细胞毒性T淋巴细胞介导的。很多学者利用特异的细胞毒性T淋巴细胞克隆,在恶性黑素瘤的抗原研究中获得较大进展,并在分子水平克隆出相应的基因。这些发现为恶性黑素瘤的细胞毒性T淋巴细胞治疗开辟了广阔的前景。     

HPV16E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定人工合成的人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞预测表位。方法 对预测的E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位运用标准Fmoc方案进行合成与纯化,采用标准⁵¹Cr释放试验检测特异性CTL诱导活性。结果 筛选并鉴定出E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)2条人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性CTL表位。结论 E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位。     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4与SLE

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4可表达于免疫细胞为主的多种细胞.细胞毒性T淋细胞相关抗原-4Ig和抗单抗是细胞毒性T淋细胞相关抗原-4用于防治自身免疫性疾病、移植排斥及肿瘤的两种分子,其效能在动物实验及临床应用中已得到证实.SLE是一种常见的累及多器官自身免疫性疾病,其免疫学特征是T细胞反应受损和B细胞活性调节障碍,从而导致B细胞高活性和产生大量自身抗体.     

含HPV16 E7的病毒样颗粒诱导小鼠产生特异性CTL反应

目的 探讨含BPVL1/HPV16E7嵌合型乳头瘤病毒样颗粒(VLPs)在动物小鼠体内的免疫学特性。方法 将HPV16E7基因分为(a)、(b)、(c)3段,与BPVL1连接后表达的BPVL1/HPV16E7(a)、(b)、(c)嵌合型VLP分别免疫小鼠C57BL/6J,对其淋巴结淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)分析。结果 接受嵌合型VLPBPVL1/HPV16E7(b)免疫的小鼠淋巴结淋巴细胞可以引发很强的对C-2细胞(HPV16E7aa47-59转染的EL-4细胞)的特异性CTL反应,但不能对EL-4细胞产生细胞毒性作用。结论 含BPVL1/HPV16E7嵌合型VLP作为抗原输送系统致敏小鼠T淋巴细胞并引发抗原特异性CTL反应,可能为HPV疫苗的设计提供一个新手段。     

HPV16E7_(11-20)配体抗肿瘤免疫的作用

目的比较HPV16型E7抗原CTL表位E711-20(YMLDLQPETT)与其修饰多肽配体APL(YLLDLQPE-VT)诱发特异CTL免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗的作用。观察E711-20及其APL的小鼠TC-1细胞肿瘤免除率、存活时间与荷瘤小鼠的肿瘤体积变化,了解其预防和治疗效果。方法以E711-20及其修饰多肽配体(APL)免疫C57BL/6小鼠,测定免疫后小鼠脾淋巴细胞的增殖指数;用LDH释放试验检测免疫后小鼠脾淋巴细胞的CTL杀伤活性。结果脾细胞增殖实验中,3组增殖指数如下:IFA+APL组2.42±0.38,IFA+E711-20组1.68±0.32,IFA组1.07±0.22;CTL杀伤效应实验中,3组靶细胞溶破率(%)如下:IFA+APL组54.21±0.12,IFA+E711-20组62.33±0.46,IFA组0.88±0.07;IFA组肿瘤免除率为0,IFA+E711-20组肿瘤免除率为40%,IFA+APL组肿瘤免除率为80%;荷瘤小鼠中,对照组IFA肿瘤体积迅速增大,E711-20和APL组的肿瘤生长速度较慢。APL免疫诱导的小鼠脾淋巴细胞,其CTL杀伤活性和增殖能力强于E711-20;APL对TC-1肿瘤细胞的预防和治疗效果优于E711-20。结论 APL诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力和抗肿瘤效果优于E711-20,可能为针对HPV16E7抗原的肽疫苗分子设计提供理想的CTL表位。     

加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。     

HPV16 CTL表位E749-57以HSP110为分子伴侣的免疫原性研究

目的 探讨以mHSP110为分子伴侣的HPV16 CTL表位E749-57的免疫原性。方法 将mHSP110基因克隆、原核表达和纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。在热休克状态与E749-57结合形成复合物,高压液相色谱（HPLC）鉴定其结合程度。用mHSP110-E749-57复合物免疫小鼠,IFN-γ胞内染色、MTT法检测小鼠脾细胞中特异CTL。结果 克隆mHSP110片段经DNA序列测定与基因库中其CDS一致,长度为2577 bp;经SDS-PAGE和Western印迹证实mHSP110表达、纯化成功,HPLC分析E749-57能够与mHSP110形成复合物。复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中CD8+IFN-γ+ T细胞的频率、脾淋巴细胞增殖活性明显高于E749-57组、HSP110组和PBS组。复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长。结论 mHSP110-E749-57复合物能诱导产生特异性CTL并产生抗肿瘤效应。     

HPV16E7靶向小干扰RNA对SiHa细胞增殖凋亡及6种抑癌基因的影响

目的：探讨HPV16E7在SiHa细胞株中对抑癌基因（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPARC、TFPI2）的表达及细胞增殖能力和凋亡水平的影响。方法 SiHa细胞转染E7SiRNA 48 h后,qPCR检测E7及6种抑癌基因mRNA水平变化,CCK?8检测细胞增殖能力改变,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果 SiHa细胞转染后48 h,qPCR结果显示实验组E7 mRNA显著降低（0.25±0.036,P<0.05）;6种抑癌基因的mRNA水平均显著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES11.720±0.060、RRAD 1.390±0.160、SFRP11.493±0.120、SPARC 2.157±0.144、TFPI22.060±0.122,P<0.05）。细胞增殖结果显示,与阴性对照组及空白组比较,实验组细胞增殖能力显著降低（0.554±0.130,P<0.05）,阴性对照组和空白组之间差异无统计学意义（P>0.05）。细胞凋亡结果提示,实验组细胞凋亡细胞频率为9.222%较阴性对照组（0.246%）及空白组（0.123%）明显增加（P<0.05）,空白组与阴性对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HPV16导致细胞恶性转化过程中,E7可能通过抑制（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPAR、TFPI2）6种抑癌基因的表达参与作用。     

温热对HPV-6/11型早期基因E6和E7表达的影响

目的 探讨不同温热条件对HPV感染皮损中E6/E7基因表达的影响.方法 采用PCR法确定6例尖锐湿疣标本HPV型别.利用37℃,42℃,45℃不同的温热条件处理置于培养液中的离体尖锐湿疣皮损,采用实时定量PCR法检测HPV-6/11型早期基因E6/E7 mRNA的表达水平.结果 6例标本中.各有1例分别感染HPV-6、HPV-11,4例同时感染HPV-6和HPV-11.E6、E7 mRNA的表达水平均随温度升高而逐渐减少.HPV-6 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.61±0.17).45℃(0.27±0.15);HPV-6 E7 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22).45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15).45℃(0.24±0.06).组间比较差异有统计学意义(P<0.01.结论 温热对HPV-6/11型E6和E7基因表达的抑制作用可能是感染消退的机制之一.     

慢病毒介导的靶向沉默HPV16E7-shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响

目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16(HPV16)E7基因的短发夹干扰RNA(shRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)表达水平的影响.方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒,用BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装,分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液.分别用含靶向HPV 16 E7-shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(shRNA组)、含空白质粒(即不含靶向HPV16 E7-shRNA序列)的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(阴性对照组)、完全培养基(空白对照组)培养SiHa细胞.感染0、48、96 h后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达,Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达.结果 感染0h时,shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P＞0.05);感染48、96 h时,3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(均P＜0.05).shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13％、50.53％、13.72％、46.27％和17.92％,96 h时分别为83.50％、74.2％、47.8％、64.7％和48.9％;而阴性对照组和空白对照组各时间点表达水平差异无统计学意义(均P＞0.05).慢病毒感染48、96 h时,3组细胞间上述4种DNMT蛋白表达量差异有统计学意义(均P＜0.01).shRNA组4种DNMT蛋白表达水平随感染时间的延长而逐渐下降,感染48 h时DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达抑制率分别为84％、37.2％、59.8％、49.3％,96 h时分别为73.1％、68.7％,55.5％、65.5％.结论 靶向沉默HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞E7基因能够干扰DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表达.     

HPV16型E7抗原B细胞表位的预测与鉴定

目的分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期蛋白E7的B细胞优势表位,并对其进行免疫原性鉴定。方法采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合评估其B细胞优势表位,并运用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定。以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。结果综合分析考虑HPV16 E714-21(P1),HPV16 E726-37(P2),HPV16 E744-51(P3)可能是B细胞优势表位,免疫小鼠后可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,但只有P1和P2产生的抗体与人宫颈癌组织上清液结合呈阳性反应。结论HPV16 E714-21和HPV16 E726-37具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。     

HPV16E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞的定位及对凋亡的影响

目的 探讨外源人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)与人Daxx蛋白(hDaxx)在HeLa细胞内的亚细胞定位及诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 Western印迹法检测融合蛋白DsRed-HPV 16 E6和EGFP-hDaxx的表达.激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6和hDaxx的亚细胞定位.将HeLa细胞分为对照组、TNF-α处理组、转染空载体组、转染HPV16 E6组、共转染HPV16 E6和hDaxx组.后4组均经TNF-α诱导.用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-8与Caspase-3的相对活性.结果 融合蛋白DsRed-HPV16E6和EGFP-hDaxx在细胞内表达并分布于胞质与胞核,出现共定位现象,且部分hDaxx从胞核转移至胞质.转染E6组凋亡率(21.4％±1.1％)低于转染空载体组(27.0％±0.9％,P＜ 0.01);与转染E6组相比较,共转染组凋亡率(32.5％±2.1％)显著升高(P＜0.01).转染E6组Caspase-8和Caspase-3相对活性分别为0.057±0.003、0.054±0.006,均低于空载体组(0.092±0.012、0.093±0.005,均P＜0.01);与转染E6组相比较,共转染组Caspase-8和Caspase-3相对活性(0.109±0.013、0.110±0.004)均显著升高(P值均＜ 0.01).结论 HPV16 E6使部分hDaxx从胞核转位至胞质,二者发生共定位.HPV16E6蛋白可抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡,bDaxx高表达可下调HPV16 E6蛋白这种作用.     

HPV16 E7对A431细胞中Smad7表达的影响

目的研究HPV16 E7对A431表皮鳞癌细胞Smad7表达的影响,并分析其潜在的意义。方法应用基因工程技术转染并筛选出稳定表达HPV16 E7的A431细胞,采用qRT-PCR、Western blotting及激光共聚焦技术,观察并比较转染前后A431细胞中Smad7的表达。结果 A431细胞中Smad7的表达强度随转染HPV16 E7后时间的延长而升高(P0.05)。Smad7蛋白的亚细胞定位,存在胞浆向胞核移位的现象。结论稳定高表达HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高,并可以影响Smad7的细胞定位。