β-防御素-2基因在子宫颈的固有表达

根据ＧｅｎｅＢａｎｋ大鼠β－防御素－２ｃＤＮＡ序列,设计特异引物：Ｒ１５′３′ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧ;Ｒ２５′３′ＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。取Ｗｉｓｔａｒ大鼠宫颈组织,用Ｑｉａｇｅｎ公司生产的ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡ,以此为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,按照试剂盒说明操作,扩增ｃＤＮＡ,反应条件下：５０℃保温３０ｍｉｎ,使ｍＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ;９４℃预变性２ｍｉｎ,然后进行３０个ＰＣＲ循环：９４℃３０ｓ,５８℃退火３０ｓ,６８℃延…     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目前丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制尚不清楚 ,病毒编码的蛋白能够影响多种细胞信号转导途径 ,从而影响肝细胞某些基因的表达、调控 ,可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因。本实验应用抑制性消减杂交(ＳＳＨ) ,构建ＨＣＶＮＳ3反式激活的相关基因ｃＤＮＡ消减文库 ,通过对所得片段进行序列同源性分析 ,筛选相关的靶基因 ,为研究ＨＣＶ致病机制提供资料。应用ＰＣＲ扩增ＨＣＶＮＳ3基因 ,并将其克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ3.1(- )中 ,构建成含有 1893ｂｐ目的基因的质粒ｐｃＤＮＡ3.1…     

脑室注射α-helical CRH对大鼠LPS性发热 及中隔区AVP含量的影响

目的和方法 :促肾上腺皮质激素释放激素 (ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ ,ＣＲＨ)是一种重要的中枢发热介质。为进一步观察ＣＲＨ在大鼠ＬＰＳ性发热中的作用 ,本研究观察了第三脑室注射ＣＲＨ受体拮抗剂α-ｈｅｌｉｃａｌＣＲＨ( 9- 41 )对ＳＤ大鼠ＬＰＳ性发热及脑中隔区精氨酸加压素 (ａｒｇｉｎｉｎｅｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ,ＡＶＰ)含量的影响。结果 :第三脑室注射 30 0ｎｇ的ＬＰＳ引起大鼠结肠温度双相性升高 ,其 3 5ｈ发热反应指数 (ｔｈｅｒｍａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｄｅｘ ,ＴＲＩ3.5)明显高于…     

大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达

设计大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ序列一对特异引物：Ｒ１５′→３′ＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧ;Ｒ２５′→３′ＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣ。根据大鼠β－ａｃｔｉｎｃＤＮＡ序列设计一对阳性对照特异引物：Ｂ１５′→３′ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧ;Ｂ２５′→３′ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。从Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮肤、肾脏、气管、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、骨髓及腮腺组织中提取总ＲＮＡ,行ＲＴ－ＰＣＲ扩增…     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的 …

目的：建立人树突状细胞的ｃＤＮＡ文库。通过大规模随机测序克隆免疫新分子,方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在Ｓｕｎ－Ｅ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛     

LR8与疾病

Ｌ Ｒ8是低密度脂蛋白受体 (Ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅ ｃｅｐｔｏｒ,ＬＤＬＲ)家族第三个被发现的成员[1] 。 1992年和 1994年Ｙａｎａｍｏｔｏ和他的同事们分别克隆了兔和人ＬＲ8的互补ＤＮＡ(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｌＤＮＡ ,ｃＤＮＡ)。最初 ,转染该ｃＤＮＡ的中国仓鼠卵巢细胞能结合极低密度脂蛋白(Ｖｅｒｙｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ,ＶＬＤＬ)和具有 β迁移率的极低密度脂蛋白 (β ｍｉｇｒａｔｉｎｇｖｅｒｙｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ,β ＶＬＤＬ)而不能结合低密度脂…     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

大鼠肝卵圆细胞体外培养过程中癌基因的表达变化及其意义

目的研究大鼠肝卵圆细胞体外培养过程中癌基因的表达变化与细胞转化的关系。方法用化学致癌剂３′ＭｅＤＡＢ诱发ＳＤ大鼠肝卵圆细胞增生,采用Ｐｅｒｃｏｌ密度梯度离心法将肝卵圆细胞进行分离和体外长期培养。在培养过程中,通过ＲＮＡＤＮＡｓｌｏｔｂｌｏｔ杂交方法,动态观察Ｈａｒａｓ、Ｋｉｒａｓ和ｃｍｙｃ癌基因的表达变化。结果卵圆细胞在培养过程中倍增时间逐渐缩短,非整倍体染色体数目增加,在软琼脂中生长的克隆增多。ｃｍｙｃ、Ｋｉｒａｓ和Ｈａｒａｓ的表达在细胞培养和转化的不同阶段均表现同步关系,即同时升高或降低。结论癌基因的表达反复升高与细胞转化过程相关联,而且,卵圆细胞的转化有赖于多个癌基因激活     

PCR-RFLP-SSCP及测序用于霍乱弧菌ctx-AB基因多态性的研究

建立ＰＣＲ ＲＦＬＰ ＳＳＣＰ及测序方法 ,用于分析霍乱弧菌肠毒素ＡＢ(ｃｔｘ ＡＢ)基因多态性。针对ｃｔｘ ＡＢ基因设计引物 ,扩增片段为 5 2 8ｂｐ ,包括ｃｔｘ Ｂ编码基因375ｂｐ ,引物序列为 5′ ＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ 3′和 5′ ＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ 3′。ＰＣＲ产物经ＲｓａⅠ酶切为317ｂｐ和 2 11ｂｐ 2个片段。对酶切产物进行单链构象多态性 (ＳＳＣＰ)分析 ,银染作者单位 :5 10 5 15广州 ,第一军医大学流行病学教研室 (芮勇宇 ,俞守义 ,王红 ) ;广东省卫生防疫站 (蔡初的 ,李建基 ,钟豪杰 )…     

酒精性肝病患者肝炎病毒的检测及其临床意义

肝炎病毒和酒精为肝实质损伤的两大主要原因。为了解酒精性肝病(Ａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓ,ＡＬＤ)重复肝炎病毒感染的状况及其临床特点,我们采用聚合酶链反应(ＰＣＲ)法、巢式ＰＣＲ法分别检测ＨＢＶＤＮＡ,ＨＣＶＲＮＡ;应用酶联免疫吸附(ＥＬＩＳＡ)法...     

变异链球菌表面蛋白抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究

变异链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ,Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)是龋病主要致病菌 ,Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的表面蛋白质抗原ＰＡｃ是其主要毒力因子之一 ,参与了唾液介导的Ｓ .ｍｕ ｔａｎｓ在牙面的粘附。Ｓ .ｍｕｔａｎｓＰＡｃ分子的氨基端不仅富集免疫显性Ｔ、Ｂ细胞表位 ,而且含有唾液糖蛋白结合区 ,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外 ,Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ(Ｓ .ｓｏｂｒｉｎｕｓ)的ＰＡｇ分子与Ｓ .ｍｕｔａｎｓＰＡｃ分子的氨基端具有保守的Ｂ细胞表位 ,以ＰＡｃ分子该区段制备的多肽疫苗…     

一种新的gp130结合分子的序列分析和真核表达

目的对以ＧＳＴ－ｇｐ１３０融合蛋白为探针，筛选人胎盘ｃＤＮＡ文库而得到的一个分子（ＧＡＭ，ｇｐ１３０ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）ｃＤＮＡ序列进行测定并做真核表达。方法进行噬菌体制备及克隆测序，并做同源性检索和构型、亲水性分析，ＣＯＳ细胞转染和３５Ｓ－蛋氨酸标记。结果所得ＧＡＭ分子与另一已克隆成功但功能还不清楚的称为ｈＡＥＳ－１的分子同源性达９７．７％。此外，ＧＡＭｃＤＮＡ还与果蝇ｅｎｈａｎｃｅｒｏｆｓｐｌｉｔ基因相关的分子有较高同源性。ＧＡＭ分子具有一个５８８个核苷酸的开放读框，编码１９６个氨基酸。将ＧＡＭ分子ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ细胞后，细胞裂解液电泳可见一分子量约为２４×１０３的表达带，与预期的分子量相符合。结论ＧＡＭ分子与ｈＡＥＳ－１分子在开放读框内仅相差一个氨基酸（且不排除测序的个别错误），其分子量也与已报道的ｈＡＥＳ－１分子量相同，故认为两者很可能是同一分子。     

多重半套式聚合酶链反应检测脑脊液中细菌16S rRNA基因

根据细菌 16Ｓ核糖体ＲＮＡ(ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ ,ｒＲＮＡ)基因兼有保守性和变异性 ,以及对于本应无菌的体液标本 (如血液、脑脊液 ) ,只要确定有细菌存在即可断定为感染之特点 ,建立了多重半套式聚合酶链扩增 (ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｓｅｍｉ ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ)的方法 ,对脑脊液标本中细菌的感染进行检测。在ＧＥＮＥＢＡＮＫ中查得常见细菌 16ＳｒＲＮＡ基因序列 ,用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行分析 ,在保守区Ｕ3 和Ｕ8各寻找一段序列作为细菌的通用引物 (上游引物Ｐｕ3:5′ＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡ3′ ,下游…     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的制备

ＣＦＰ10和ＥＳＡＴ6都是结核分枝杆菌(Ｍ .ｔｂ)特有的、有良好抗原性的分泌性蛋白 ,将其编码基因 1ｈｐ和ｅｓａｔ6用ＧｅｎｅＳＯＥｉｎｇ法通过Ｌｉｎｋｅｒ (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3构建成融合基因 ,并克隆入ｐＱＥ30质粒 ,表达、纯化、鉴定ｒＣＦＰ10 ＥＳＡＴ6 ,为其应用于Ｍ .ｔｂ感染的诊断和预防奠定基础。1 1ｈｐ ｅｓａｔ6基因的构建 :以已构建的ｐＱＥ30 ＣＦＰ10质粒为模板 ,用引物(Ｐ1) 5′ ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ 3′和 (Ｐ2 ) 5′ ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣ…     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

编码基因pac的DNA疫苗经胃肠粘膜免疫SD鼠的研究

变形链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ ,Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)是主要的致龋菌 ,细菌表面蛋白ＰＡｃ是其主要的毒力因子之一。抗ＰＡｃ抗体能有效阻止Ｓ .ｍｕｔａｎｓ在牙面的非蔗糖依赖性粘附 ,从而可以预防龋病的发生。ＤＮＡ防龋疫苗的成功研制〔1,2〕,给免疫防龋的粘膜免疫提供了崭新的思路。核酸疫苗经粘膜免疫可以通过共同粘膜免疫系统 (ｃｏｍｍｏｎｍｕｃｏｓａｌｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ ,ＣＭＩＳ)诱导循环及粘膜特异性抗体的反应 ,更重要的是粘膜ＩｇＡ的应答 ,这无疑是免疫防龋的关键所在。本实验用ｂｕｐｉｖａｃ…     

AngiostatinK（1—3）基因真核表达载体的构建,鉴定和表达

构建携带人ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ的真核表达载体,并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤ－ＮＡ－ＳＡＫ（１０３）,采用酶切鉴定结果。     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

大鼠损伤性周围神经组织cDNA文库的构建

为克隆神经损伤及再生过程中出现的诱向因子和营养因子基因，以ＳＤ大鼠手术损伤的坐骨神经组织为材料，提取ｍＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ，以λｇｔ１１为载体，构建了一个ｃＤＮＡ文库。     

115 IL-20：发现、受体鉴定及其在表皮功能中的作用

用一种专为鉴定在螺旋细胞因子中常见的既有一段信号序列同时又有一个或多个两性螺旋的翻译序列的计算方法 ,对ＥＳＴ资料库进行搜索 ,其中得分最高的一个是来自人角质细胞文库 (ＩｎｃｙｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ,Ｉｎｃ.)的ＥＳＴ(ＩＮＣ8195 92 )。在此ＥＳＴ序列的基础上 ,设计了一些嵌套的寡核苷酸作引物 ,以人的皮肤、气管分离得到的ＲＮＡ作模板进行 3′ｃＤＮＡ末端快速扩增 (3′ＲＡＣＥ) ,得到了编码序列之外的部分即 3′非编码区 (ＵＴＲ)和多聚腺苷酸化序列。该ｃＤＮＡ的 3′ＵＴＲ包括 7个ＡＵＵＵＡ和一个在细胞因子ｍＲＮＡ中常…