苏云金芽孢杆菌杀蚊蛋白基因cry11Aa的克隆与表达

目的 克隆苏云金芽孢杆菌以色列亚种的杀蚊毒素蛋白基因cry11 Aa，并使其在酵母双杂交系统受体菌Saccharomyces cerevisiae L40中获得表达。方法 应用聚合酶链反应扩增获得cry11 An基因，构建表达载体pHybLex／Zeo-cry11 Aa，转化到酵母菌Saccharomyces cerevisiae L40。结果 用CryllAa抗体和LexA抗体进行的Western blot免疫杂交表明cry11Aa基因在酵母菌L40中成功表达，生成了Cry11 Aa-LexA融合蛋白。结论 成功地克隆、表达了cry11Aa基因，为进一步利用酵母双杂交系统寻找与毒素蛋白Cry11Aa特异性结合的蚊幼中肠受体蛋白，揭示苏云金芽孢杆菌毒杀蚊虫的分子生物学机制奠定了基础。     

大肠埃希菌表达苏云金杆菌cryIVD基因杀蚊幼活性观察

目的 :观察表达B .t.icryIVD基因的大肠埃希菌对蚊幼虫的毒效。 方法 :细菌的诱导表达及蚊虫毒效测试。结果 :加入工程菌 48h对淡色库蚊和白纹伊蚊均具有明显的杀灭作用 ,LC50 分别为 2 .3 8× 10 6 、1.6× 10 7个 ml细胞 ,其中对淡色库蚊的杀灭作用要好于对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果。结论 :单独表达B .t .icryIVD基因具有杀蚊作用     

基因工程杀蚊幼蓝藻的研究

应用基因工程手段研制杀蚊幼蓝藻,是解决苏云金杆菌和球形芽孢杆菌等短持效问题的途径之一。但国际上基因工程蓝藻的毒效一直限于较低水平,甚至需要破碎细胞才能检测到对蚊幼虫的毒杀作用。本文将球形芽孢杆菌毒素基因装配鱼腥藻启动子后,转移入鱼腥藻进行表达,所得基因工程株对蚊幼虫具有十分显著的毒效,对淡色库蚊幼虫24h半致死浓度为2.31×10~4细胞/ml;其对淡色库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊幼虫的毒效依次递减,这与球形芽孢杆菌相似。由于鱼腥藻易培养、生态适应性广等,可望成为蚊虫特效控制的新型武器。     

苏云金杆菌(BTH-14)和球形芽孢杆菌(BS-10)混合液对营口市区库蚊蚊幼的毒力测定

目的：测定BTH-14和BS-10对蚊幼的毒力,为使用生物杀虫剂灭蚊提供科学依据.方法：采用液浸法,用苏云金杆菌（BTH-14）和球形芽孢杆菌（BS-10）混合液按不同浓度对不同龄期、不同种蚊幼进行敏感性测定.结果：蚊幼龄期越小,对生物制剂越敏感.凶小库蚊和淡色库蚊的相对敏感性大体一致.结论：相同浓度的生物制剂对龄期较小的幼虫有较强的杀灭率.     

苏云金杆菌CryIVD转基因工程藻不同贮存时间对淡色库蚊不同龄期幼虫的杀灭效果

目的观察苏云金杆菌CryIVD转基因贮存藻对不同龄期淡色库蚊幼虫的杀灭效果。方法大量培养工程藻,干燥后保存,应用不同时间的贮存藻作用于不同龄期淡色库蚊幼虫。结果干燥贮存的工程藻数年后仍有较高的杀蚊毒效,尽管杀蚊毒效较新鲜工程藻有所下降,但在105个/ml数量级不同龄期的幼虫仍有50%以上死亡。对不同龄期淡色库蚊幼虫杀灭效果比较表明,1~3年贮存藻3组比较,在106个/ml数量级浓度的蚊幼虫死亡率差异无统计学意义（F=9.32,P〉0.01）,而贮存1年组和3年组在105个/ml数量级浓度及以下,死亡率差异有统计学意义（F=101.21,P〈0.01）。结论转基因蓝藻在干燥贮存情况下仍能保持毒蛋白的稳定遗传和杀幼虫作用,为今后的现场应用提供更方便的选择。     

球形芽孢杆菌C_（3－41）菌株杀蚊毒蛋白的生物合成

本文报道球形芽孢杆菌Ｃ３－４１菌株毒蛋白的生物合成的检测结果。对Ｃ３－４１菌株不同发育阶段发酵液的毒蛋白量进行了酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ），并用生物测定方法检测了发酵液杀蚊毒性，证明其毒蛋白合成量与该菌芽孢的发育和形成密切相关，同时揭示了ＥＬＩＳＡ测出的毒蛋白量与生物测定所示的杀蚊毒力具有很高的符合率。     

老年患者大肠埃希菌分离株对氯霉素耐药性及耐药相关基因研究

目的了解老年患者耐氯霉素大肠埃希菌基因存在状况。方法采用聚合酶链反应及序列分析20株大肠埃希菌的catB和cmlA基因。结果catB和cmlA基因的阳性率均为20％，有2株大肠埃希菌catB和cmlA基因同时阳性。结论临床分离的耐氯霉素大肠埃希菌与产生耐药基因密切相关，在大肠埃希菌中检出catB和cmlA基因均为国内首次报道。     

多药耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因研究

目的 明确临床分离的多药耐药铜绿假单胞菌(MRPA)耐药性及各种β-内酰胺酶编码基因、外膜通道蛋白oprD2基因、氨基糖苷类修饰酶相关基因、消毒剂与磺胺类耐药基因和质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因存在状况.方法 对2006年7-12月临床分离的32株铜绿假单胞菌,用K-B纸片扩散法和微量稀释法测定对庆大霉素等15种抗菌药物的敏感性,用聚合酶链反应(PCR)法检测28种铜绿假单胞菌相关耐药基因及外膜通道蛋白oprD2基因.结果 32株MRPA对阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、哌拉西林的耐药率分别为9.4%、25.0%、59.4%、68.7%、68.8%、78.1%、81.1%、81.3%、84.4%、94.4%,对其他抗菌药物耐药率均为100.0%,检出氨基糖苷类修饰酶基因aac(6')-Ⅱ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、aph(3')-Ⅵ、ant(3")-Ⅰ和aac(3)-Ⅰ基因的阳性率分别为68.8%、62.5%、21.9%、9.4%、9.4%和6.3%,检出β-内酰胺酶编码基因blafox、blaIMP、blaVIM和blaDHA基因阳性率分别为37.5%、15.6%、6.3%和9.3%,22株(68.8%)外膜通道蛋白oprD2基因缺失,9株(28.1%)qacE△-sull基因扩增阳性,而其他基因均阴性.结论 临床分离的多药耐药铜绿假单胞菌,氨基糖苷类修饰酶基因和β-内酰胺酶编码基因携带率很高,oprD2基因缺失率高.     

泛耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因研究

目的 了解1株对临床常用18种抗菌药物(包括亚胺培南、美罗培南)均耐药的肺炎克雷伯菌(KPN)所携带的耐药基因状况.方法 对该株KPN进行了9类耐药基因的PCR法检测,包括β-内酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaLEN、blaOKP、blaCTX-M-1、2、9群、blaOXA-1、2、10群、blaCARB、blaPER、blaVEB、blaGES、金属β-内酰胺酶基因blaIMP、blaVIM、blaKPC,AmpC酶基因blaDHA、blaACT/MIR、blaCMY/MOX、blaCMY/LAT,氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ,喹诺酮类耐药基因qnrA、TMP耐药基因dfrA1、dfrA17,消毒剂磺胺耐药基因qacE△1-sul1,整合子遗传标记基因intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3,转座子遗传标记基因tnpA、merA,共计36种.结果 KPN共检出7种耐药基因,分别为β-内酰胺酶基因blaTEM,blaSHV,金属β-内酰胺酶基因blaKPC-2,氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-Ⅱ,ant(3")-Ⅰ,消毒剂磺胺耐药基因qacE△1-sull,整合子遗传标记基因intⅠ1.结论 在该株泛耐药KPN中发现了少见的blaKPC-2金属β-内酰胺酶基因,该菌对18种抗菌药物的耐药可能与其同时携带有多种耐药基因有关,临床应对此类菌株引起重视.     

志贺菌属对复方新诺明耐药相关基因研究

目的 明确志贺菌属(SHI)对复方新诺明的耐药基因.方法 采用纸片扩散法进行药敏试验;采用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌属对复方新诺明耐药基因(sul1、dfrA1、dfrA5、dfrA12、dfrA17);并应用DNA测序确定基因型.结果 检出20株志贺菌属对复方新诺明耐药率为95.0%;检出复方新诺明sull、dfrA1、dfrA12、dfrA17基因阳性率分别为15.0%、100.0%、5.0%、0;dfrA1阳性基因测序比对与美国核酸库(GenBank)已登录的dfrA1序列均100.0%相同.结论 志贺菌属对复方新诺明耐药与携带sul1、dfrA1基因相关.     

鲍氏不动杆菌流行株耐药基因及菌株亲缘性分析

目的 了解鲍氏不动杆菌(ABA)流行株耐药基因携带状况和菌株的亲缘性,为医院流行病学溯源提供依据.方法对39株ABA采用PCR检测19种耐药基因(TEM、SHV、PER、VEB、GES、CARB、CTX-M-1群、OXA-23群、OXA-24群、IMP、VIM、DHA、aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ、ant(2")-Ⅰ、qacE△1-sull).结果 TEM阳性13株(33.3%)、OXA-23群阳性20株(51.3%)、aac(3)-Ⅰ阳性25株(64.1%)、aac(6')-Ⅰ阳性25株(64.1%)、ant(3")-Ⅰ阳性29株(74.4%)、qacE△1-sull阳性32株(82.1%),其余基因均阴性;聚类分析提示存在克隆传播现象.结论 ABA流行株β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶和消毒剂-磺胺耐药基因携带率高,存在克隆传播医院感染流行的危险.     

葡萄球菌属连续分离株毒力与耐药基因研究

目的了解金黄色葡萄球菌（SAU）和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）连续分离株的pvl毒力基因与β-内酰胺类、氨基糖苷类、红霉素类、四环素类、消毒剂耐药基因状况。方法收集了100株SAU和27株CNS连续分离株,进行pvl、mecA、aac（6＇）/aph（2＇＇）、aph（3＇）-Ⅲ、ant（4＇,4＇＇）、ermA/B/C、msrA、tetM、qacA/B基因检测。结果SAUmecA基因阳性69株（69.0%）和CNSmecA基因阳性16株（59.3%）,SAUmecA基因阳性株（MRSA）pvl、aac（6＇）/aph（2＇＇）、aph（3＇）-Ⅲ、ant（4＇,4＇＇）、ermA/B/C、tetM、qacA/B基因检出率高于mecA基因阴性株（MSSA）。结论SAUmecA基因阳性株（MRSA）氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类耐药相关基因检测结果均支持MRSA具耐多药特征;本组SAUmecA基因阳性的69株中8株携带pvl基因,即同时携带pvl毒力基因与β-内酰胺类、氨基糖苷类、红霉素类、四环素类、消毒剂耐药基因,此类“超级细菌”应为临床防控重点。     

大肠埃希菌尿液分离株7种抗菌制剂外排泵基因研究

目的调查7种抗菌制剂外排泵基因(smr-2、emrB、emrD、emrE、mdf A、tehA、qacE△1)在大肠埃希菌尿液分离株中的存在情况。方法收集宁波市第一医院2008年10月～2009年3月患者尿液标本中分离的大肠埃希菌共28株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析7种外排泵基因。结果6种外排泵基因emrB、emrD、emrE、mdf A、tehA、qacE△1的阳性株数分别为26株(92.9%)、17株(60.7%)、21株(75.0%)、28株(100.0%)、27株(96.4%)、19株(67.9%),只有smr-2未能检出;且这6种外排泵基因以11种阳性模式存在,其中6种基因同时检出的模式:emrB+emrD+emrE+mdf A+tehA+qacE△1检出率最高,共9株(32.1%);另外,1号株mdf A和tehA的基因序列与美国NCBI中已登录的相关序列比对后,发现均为同义突变的新基因型。结论同时检测这7种抗菌制剂外排泵基因中6种基因在大肠埃希菌尿液分离株中被检测到,且阳性率很高,这或许是导致分离株呈多药耐药的一个重要原因。     

多重耐药淋病奈瑟球菌耐药基因的研究

目的探讨淋病奈瑟球菌多重耐药与耐药基因的关系. 方法 应用K-B法与琼脂稀释法测定35株淋菌对抗生素的敏感性,煮沸法提取菌株DNA,PCR扩增TEM、tetM、erm和mefA基因. 结果 35株淋菌的敏感性测定显示:多重耐药现象明显,TEM耐药基因的检出率为88.6%,tetM基因的携带率为11.4%,首次在国内从35株淋菌中检出mef、erm耐药基因,其中mefA基因2株阳性,erm基因1株阳性. 结论淋菌的多重耐药与各耐药基因型之间密切相关.