携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体对B16黑色素瘤的抑制作用

目的 :观察携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体 ( Ad CMVGM- CSF)对B1 6黑色素瘤的致瘤性及抑制作用。方法 :将 B1 6黑色素瘤细胞与 Ad CMVGM- CSF在 37℃、5 %CO2 培养箱中孵育 ( RPMI- 1 640培养基 ) 2 h后注射到 C5 7BL/ 6小鼠右侧背部皮下 ( MOI=5 0 0 ) ,观察 Ad CMVGM- CSF对 B1 6黑色素瘤致瘤性的抑制作用 ;观察瘤内一次注射及二次注射对 B1 6黑色素瘤的抑制作用。结果 :Ad CMVGM- CSF能有效地抑制 B1 6黑色素瘤细胞的致瘤性 ,抑瘤率达 60 %;瘤内一次注射 Ad CMVGM- CSF可延缓肿瘤的生长 ,二次瘤内注射 Ad CMVGM- CSF能够强化抗肿瘤效果。结论 :Ad CMVGM- CSF具有抑制肿瘤生长的作用     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

含鼠白细胞介素12基因腺病毒载体对小鼠支气管哮喘模型肺组织GATA-3表达的影响

目的：探讨含鼠白细胞介素12（IL-12）基因的腺病毒载体（AdCMVIL-12）对小鼠支气管哮喘模型GATA-3表达的影响。方法：BALB/c小鼠30只,随机分为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）和AdCMVIL-12实验组（C组），B和C组建立哮喘模型，并于第20天分别鼻内吸入50 μL生理盐水和5×10⁸ PFU AdCMVIL-12。第28天收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF），比较细胞总数及细胞分类的变化，HE染色观察小鼠支气管及肺组织的病理变化，免疫组化及RT-PCR方法检测各实验组肺组织中GATA-3的表达情况。结果：哮喘模型组与对照组及AdCMVIL-12实验组比较，小鼠肺组织有大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主。免疫组织化学及RT-PCR结果显示，哮喘模型组小鼠肺组织GATA-3表达（0.48 ±0.06）明显高于实验组（0.16±0.07）及对照组（0.18±0.04 ）(P<0.01)。结论：AdCMVIL-12对小鼠支气管哮喘的气道及肺组织炎症有明显的抑制作用，其机制可能与AdCMVIL-12阻断GATA-3的表达,调节Th₁/Th₂细胞因子的平衡有关。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响

目的：探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用。方法：碱裂解法提取纯化质粒DNA，微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤；建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞，待肿瘤直径达0.3~0.5 cm时开始治疗；肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次，并给予3次X线照射，观察小鼠移植肿瘤的生长情况。结果：pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率最低，小鼠生存时间明显延长（P<0.01~P<0.001），末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%，而且其中有1只小鼠肿瘤消退。结论：多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长，其效果好于单基因治疗和单纯放疗。     

重组腺病毒载体含人抑瘤素的扩增及纯化

目的：构建含人抑瘤素(HOSM)基因的重组腺病毒载体，观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：用脂质体介导质粒DNA同源重组方法构建HOSM基因的重组缺陷型腺病毒载体，用聚合酶链反应(PCR)法鉴定所构建的ad-HOSM载体，在人胚肾细胞(293细胞)中扩增病毒。CsCl梯度超速离心纯化病毒，噬斑法测定病毒的滴度。结果：获得了高纯度、高滴度的重组腺病毒载体。结论：细胞内质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒载体，293细胞能有效扩增病毒。CsCl梯度超速离心法能制备高纯度的病毒，为进一步研究重组腺病毒介导HOSM基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响打下基础。     

腺病毒介导的细胞因子基因转染对小鼠巨噬细胞功能的影响

探讨重组腺病毒介导的细胞因子基因转染对巨噬细胞体外抗肿瘤免疫功能的影响。方法通过重组腺病毒的介导，将白细胞介素４（ＩＬ－４）及巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）基因转染至小鼠腹腔内巨噬细胞，并检测其上清中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ的水平；同时检测基因转染后巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，及其分泌的肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ－１、一氧化氮（ＮＯ）水平与主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）Ⅱ类分子的表达情况。结果基因转染后４小时，巨噬细胞即可表达较高水平的ＩＬ－４和（或）Ｍ－ＣＳＦ，转染后１８小时，巨噬细胞上清中ＩＬ－４水平为９５Ｕ／ｍｌ，Ｍ－ＣＳＦ为３５Ｕ／ｍｌ；转染后巨噬细胞杀伤活性明显升高，两者联合应用并以内毒素脂多糖（ＬＰＳ）协同刺激时，这一升高更为明显；其上清中ＴＮＦ、ＩＬ－１及ＮＯ水平均有不同程度的升高；ＭＨＣⅡ类分子的表达在ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ联合转染组有所增强。结论巨噬细胞中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ基因的表达可以增强其抗肿瘤免疫功能。     

体内IFN—γ基因转染巨噬细胞对化疗小鼠免疫功能的影响

采用磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法，将ＩＦＮ－γ真核表达质粒直接注射至经大剂量化疗后的小鼠腹腔内，可成功地转染腹腔巨噬细胞（ＭΦ），并表达基因产物，能刺激脾脏增生，促进淋巴细胞增殖，增加腹腔巨噬细胞数量，提高腹腔ＭΦ的细胞毒活性，诱导腹腔ＭΦ产生ＩＬ－１，ＴＮＦ和ＮＯ。实验结果提示：ＩＦＮ－γ基因转染ＭΦ可增强化疗后受损机体的免疫功能。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染小鼠黑色素瘤B16F1细胞

目的：探讨基因转移载体脂质体介导转染的鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF)基因在B16F1细胞的表达动态及表达产物的生物活性。方法：脂质体和质粒DNA复合，转染10^6 B16F1细胞，连续5d换细胞培养液，并检测其中的mGM-CSF含量。采用[^3HTdR]渗入法，测定DA1G细胞和转染后第一天收获的以1：10对倍稀释到1：640的上清液及[^3HTdR]混合培养后，渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)，以分析表达产物的生物活性。结果：转染B16F1细胞的mGM-CSF基因得到有效表达。但随着时间的推移，表达由第1天的135ng/ml下降到第5天的42.2ng/ml。渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)随上清液的稀释而逐步下降，由1：10稀释度的9371下降到1：640时的3251。和DMEM混合培养的DA1G细胞的[^3HTdR]渗入量（cpm)仅为472。结论：脂质体作为基因转移载体可有效地介导mGM-CSF基因转染B16F1细胞，并获得有生物活性的表达。     

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

IL-2/GM-CSF 体外处理的外周血单个核细胞对再生障碍性贫血小鼠T 淋巴细胞亚群及细胞因子的影响

目的 探讨白细胞介素-2（IL-2）/ 粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）体外处理的外周血单个核细胞输注对再生障碍性贫血（以下简称再障）小鼠T 淋巴细胞亚群和细胞因子的影响及其促造血作用。方法 选取清洁级雌性BALB/c 小鼠并复制免疫介导再障小鼠模型,设立对照组、模型组及干预组。干预组取正常同源小鼠外周血单个核细胞,在IL-2、GM-CSF等作用下培养48 h 后进行尾静脉输注（模型复制第1、2、4 及6 天）,模型组输注等体积生理盐水。全部小鼠分别于模型复制第7、14、21 及28 天断尾采血检测外周血白细胞、血红蛋白和血小板计数;于模型复制第28 天或濒死时处死小鼠,计数骨髓有核细胞（粒系、红系、淋巴细胞比例及巨核细胞数）,检测外周血CD3+CD4+（T 辅助细胞、Th 细胞）、CD3+CD8+（T抑制细胞、Ts 细胞）及CD4+CD25+CD127-（调节性T 细胞、T-regs）细胞比例,检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ 干扰素（IFN-γ）水平。结果 模型组和干预组外周血WBC 较对照组低（P <0.05）,干预组在第21 和28 天较模型组高（P <0.05）。模型组和干预组外周血PLT 较对照组低（P <0.05）,干预组在第21 和28 天较模型组高（P <0.05）。模型组和干预组外周血Hb 较对照组低（P <0.05）,干预组在第28 天较模型组高（P <0.05）。模型组和干预组粒系比例、红系比例及巨核细胞数较对照组低,淋巴细胞比例较对照组高（P <0.05）,干预组骨髓粒系比例、红系比例及巨核细胞数较模型组高,淋巴细胞比例较模型组低（P <0.05）。模型组Th 细胞比例、T-regs 细胞比例较对照组低（P <0.05）,Ts 细胞比例较对照组高（P <0.05）。干预组Th细胞比例、T-regs 细胞比例较模型组高,Ts 细胞比例较模型组低（P <0.05）。模型组外周血TNF-α、IFN-γ水平较对照组高（P <0.05）,干预组较模型组低（P <0.05）。结论 IL-2/GM-CSF 体外处理的外周血单个核细胞输注有助于调节再障小鼠T 淋巴细胞亚群紊乱,下调造血负调控细胞因子,从而改善骨髓造血功能。     

糖尿病小鼠创面愈合过程中炎症细胞和GM-CSF表达

目的研究糖尿病创面愈合过程中炎症细胞数量和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达的变化,探讨GM-CSF在糖尿病创面延迟愈合中的作用。方法70只C57BL/6小鼠分为野生小鼠组(对照组,n=35)和糖尿病模型组(DM组,n=35)。腹腔麻醉后在背部中线两侧各制作0.8 cm×0.8 cm创面。创面动态摄像并于相应时间段取标本,观察创面组织愈合情况,同时计算创面愈合率;免疫组化染色结合计算机图像分析计数创面中性粒细胞和巨噬细胞;ELISA法测定创面GM-CSF表达。结果创面形成后第3天起,DM组小鼠创面愈合率较对照组明显下降,以创面形成后7 d内变化最为明显;DM组中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况,在创面愈合早期显著少于对照组,而在后期则较对照组略为增多;创面形成后第1天,两组小鼠创面GM-CSF表达均明显增高;创面形成后第1天和第3天,对照组小鼠创面GM-CSF表达显著高于DM组。结论炎症细胞浸润延迟可能是糖尿病小鼠创面愈合率低的重要原因;而GM-CSF的低表达则可能与创面愈合早期炎症细胞浸润减少有关。     

白细胞介素-24基因对B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用

[目的]探讨重组质粒pEGFP-N1-白细胞介素(IL)-24基因对黑色素瘤B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用及其机制.[方法]构建黑色素瘤B16细胞小鼠模型,随机分为3个组,分别向各组小鼠瘤体内注射给予脂质体包裹的基因重组质粒pEGFP-N1-IL-24(实验组),pEGFP-N1(阳性对照组)和PBS缓冲液(阴性对照组).应用HE染色对肿瘤组织形态进行观察,RT-PCR法测定移植瘤中Bax,Bcl-2,VEGF的表达,Western Blot方法研究肿瘤细胞凋亡情况.[结果]HE染色观察结果显示,实验组肿瘤组织细胞变大、胞质疏松、核深染,可见核固缩、核溶解、核碎裂.RT-PCR实验扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果示,实验组Bax基因及Bax蛋白的表达均较其他两组明显升高(P<0.05),而实验组Bcl-2和VEGF基因及Bcl-2和VEGF蛋白的表达均较其他两组明显降低(P<0.05).[结论]IL-24对小鼠体内的黑色素瘤B16细胞的生长有抑制作用.     

GM-CSF表达质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗的增强作用

目的:观察粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗免疫作用的影响,为柯萨奇病毒B组3型(CVB3)疫苗的研制提供理论和实验依据。方法:4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/mGM-CSF组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mGM-CSF混合注射组,每组10只。每3周接种1次,共3次。每次接种的第20天眼眶采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度明显提高,小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均有增强。结论:GM-CSF可以增强pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗的特异性免疫应答。