脐血树突状细胞的诱导和体外抗肿瘤研究

目的：用细胞因子诱导脐血干细胞分化为树突状细胞(dendritic cells，DC)，并观察脐血来源DC疫苗在体外对人肝癌细胞的杀伤活性。方法：用CD34^ 细胞分选试剂盒和Mini MACS从脐血单个核细胞中分离CD34^ 干细胞。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子100μg／ml、重组人肿瘤坏死因子-α50U／ml诱导CD34^ 干细胞向DC分化，     

未成熟树突状细胞快速分离与体外诱导培养及其鉴定研究

目的:以人外周血来源的单核细胞为前体细胞,建立体外快速分离和诱导培养未成熟树突状细胞(Immature dendritic cell,iDC)的方法。方法:采用Ficoll 密度梯度离心方法和MACS 磁珠分选系统,收集高纯度CD14+ 单核细胞;用rhGM-CSF、rhIL-4 联合诱导培养CD14+单核细胞,第4 天获得未成熟树突状细胞(iDC),应用流式细胞术检测细胞表面标记(CCR5)和抗原吞噬能力,普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞表面和内部结构特征。结果:CD14 免疫磁珠技术获得CD14+单核细胞纯度达94%以上,诱导分化第4 天的iDC 具有CCR5 特征性标志和吞噬能力,普通光学显微镜及电镜观察到iDC 出现树突状细胞典型特征。结论:体外快速诱导培养是获得大量具有典型特征的iDC 的有效方法,并可应用于进一步实验研究。     

不同细胞因子诱导的小鼠骨髓树突状细胞亚群与小鼠脾脏树突状细胞亚群的比较

目的对粒-单集落刺激因子(GM-CSF)/白介素4(IL-4)或脱氧氟胸腺嘧啶配体(Flt3-L)体外诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)亚群和正常小鼠脾脏DC亚群进行比较,探索诱生DC的特性。方法分离Balb/c小鼠骨髓细胞,分别加入含GM-CSF/IL-4或Flt3-L的培养液,体外培养7d,倒置显微镜观察细胞形态,并用流式细胞术检测CD11c、MHCⅡ、CD4、CD8α、CD45RA及Sirp-α分子;利用免疫磁珠从小鼠脾脏细胞中分离DC。结果两组细胞因子均可在体外诱导小鼠骨髓细胞分化发育为未成熟的DC;倒置显微镜下观察可见BMDCs表面有树突状突起,具有典型的DC形态学特点,与Flt3-L诱导的BMDC相比GM-CSF/IL-4诱导的DC体积大,树突长;但是,流式细胞术检测发现Flt3-L体外诱导的BMDCs与小鼠脾脏DC亚群更为相似。结论 GM-CSF/IL-4及Flt3-L均可在体外诱导小鼠骨髓细胞分化发育为DC,且Flt3-LDC亚群与脾脏DC亚群相似,有可能成为体外研究脾脏来源DC的一种方法。     

IL-37抑制脂多糖诱导的小鼠树突状细胞活化

目的探讨白细胞介素37(IL-37)对细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠树突状细胞(DC)活化的调节作用。方法应用GM-CSF和IL-4诱导小鼠骨髓细胞向DC分化,抗CD11c磁珠分选DC。IL-37预处理DC后,进行LPS刺激。流式细胞术检测DC表面共刺激分子(CD80、CD86)表达水平,实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6和IL-1αmRNA表达水平,流式细胞微球芯片试剂盒(CBA试剂盒)检测细胞培养上清中IL-1α、IL-6、TNF-α等因子的浓度。结果 DC诱导成功,磁珠分选能够获得高纯度的DC(>90%)。IL-37降低LPS诱导的DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达,并抑制DC合成IL-1α、IL-6、TNF-α。结论 IL-37可以通过降低共刺激分子和炎症因子的表达抑制LPS刺激的DC活化。     

用含有特定细胞因子的无血清培养基培养慢性乙型肝炎病人的树突状细胞

目的　体外扩增慢性乙肝病人的树突状细胞 (dendriticcell,DC) ,从细胞表型和功能上鉴定和研究。方法　用含GM CSF和IL 4的无血清培养基AIM V体外培养慢性乙肝病人外周血单个核细胞 ,获得树突状细胞。流式细胞仪检测细胞表型 ,IL 1 2ELISA试剂盒检测DC分泌IL 1 2的水平 ,并观察加入细胞因子TNF α后对DC培养的影响。结果　慢性乙肝病人的外周血单个核细胞用AIM V培养及细胞因子诱导后 ,经贴壁法纯化 1 0 0mL可获得 0 .5× 1 0 7～ 1 .5× 1 0 7成熟的具有典型形态的DC ,加入TNF α后 ,CD83阳性占 60 .80 % ,明显高于未加组 (P <0 .0 5) ,IL 1 2分泌较未加TNF α组增高近 1 0倍。结论　①慢性乙肝病人的DC可用AIM V无血清培养基及特定的细胞因子诱导在体外大量获得 ,TNF α是诱导DC成熟的重要的细胞因子。②典型的细胞形态和CD1 4 -、HLA DRhigh+、CD86high+的细胞表面分子特征可作为临床上快速鉴定培养DC的标志。     

间充质干细胞诱导小鼠CD8α+ CD11b+ jagged2high调节性树突状细胞的方法

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导CD8α+CD11b+jagged2high调节性树突状细胞(DCregs)的方法。方法:应用4种细胞因子体外刺激BALB/c(H-2d)小鼠骨髓有核细胞(BMCs)3 d,流式细胞术(FCM)分选树突状细胞(DCs),与BMSCs共培养10 d,诱导DCregs产生。FCM分析共培养前后DCs的表型、细胞周期及Notch信号通路中Jagged1、Jagged2配体的表达变化。结果:小鼠BMSCs在体外成功诱导新型DCs转变为DCregs,其CD86、CD80、CD40、MHC-II表达均明显下降(P<0.05),而CD205、Jagged1、Jag-ged2表达均明显上升(P<0.05);细胞周期中(G2+S)期细胞增加。结论:MSC可诱导DC细胞向DCregs转化,该MSC-DCregs具有致免疫耐受性表型,增殖能力提高;MSC诱导免疫耐受的机制可能与上调DC的Jagged1和Jagged2基因表达,激活T细胞Notch信号通路相关。     

大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞的培养及鉴定

目的培养及鉴定大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞(DC)。方法分离大鼠外周血及骨髓单个核细胞,加入20 ng/m L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10 ng/m L白细胞介素4(IL-4)培养10 d。流式细胞术检测CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)、整合素分子OX62的表达确定未成熟DC。成熟的DC在加入以上剂量的GM-CSF、IL-4处理基础上,再加入4μg/L肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理,流式细胞术检测CD80、CD86、MHCⅡ、OX62的表达,光镜及透射电镜检测细胞形态。结果流式细胞术检测结果表明,外周血来源的DC OX62表达较高、骨髓来源的DC的OX62表达较低,经TNF-α诱导后,外周血来源的成熟DC和骨髓来源的成熟DC的OX62水平均明显增加。两种方法提取的DC光镜下形态无差别,电镜下可见外周血来源的成熟DC的突起明显多于骨髓来源的成熟DC。结论外周血更容易获得和诱导高纯度的成熟DC。     

两步法从慢性髓系白血病患者骨髓CD34+细胞体外扩增诱导树突状细胞

目的探讨从慢性髓系白血病(CML)患者骨髓CD34~ 细胞体外扩增诱导树突状细胞(DC)的可行性,并比较CML-DC和正常DC的生物学特性。方法免疫磁珠法从CML患者和正常供者骨髓纯化CD34~ 细胞,在有血清条件下应用两步法:干细胞生长因子(SCF) FLT3配体(FL) 促血小板生成素(TPO) 白细胞介素-3(IL-3)扩增2周,然后以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 白细胞介素-4(IL-4) 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(GI方案)诱导DC。通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪分析DC的生物学特性,荧光原位杂交(FISH)检测培养前后CML细胞的bcr/abl融合基因表达。结果诱导后细胞较0d或诱导前细胞高表达DC相关抗原(CD1a,CD80,CD86,CD40,CD54,HLA-DR)。CML患者和正常供者CD34 细胞经GI方案诱导10d,CD1a阳性率分别为36.90%±26.94%和54.35%±16.34%,CD1a~ DC数是0d接种细胞的(54±54)倍和(122±129)倍。两组相比,总细胞扩增倍数、DC扩增倍数、细胞表型均无明显差异,诱导后的DC具有相似的超微结构。CML患者CD34~ 细胞诱导10d后bcr/abl融合基因阳性率为43.67%±21.55%,具有典型DC形态的细胞bcr/abl融合基因阳性率为53.2%。结论两步法GI方案能诱导CMLCD34~ 细胞产生大量DC,诱导生成的DC不但具有正常DC的典型形态、表型,而且起源于CML细胞。     

骨髓CD34+细胞体外扩增诱导树突状细胞实验研究

目的探讨应用不同细胞因子组合方案从骨髓CD34+细胞体外扩增诱导树突状细胞(DC)的可行性及评价不同诱导方案诱导DC的效果.方法免疫磁珠法纯化骨髓CD34+细胞.在有血清条件下应用两步法SCF+FL+TPO+IL-3扩增2周,然后以GM-CSF+IL-4+TNF-α(GI方案)或GM-CSF+TNF-α(GT方案)诱导DC;或者一步法SCF+FL+TPO+IL-3+GM-CSF+TNF-α直接作用2周扩增诱导DC.通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪分析、异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-DX)内吞实验检测DC的生物学特性.结果诱导后细胞较0 d或诱导前细胞高表达DC相关标记(CD1a、CD80、CD86、CD40、CD54、HLA-DR).两步法GI方案诱导10 d,总细胞扩增倍数、CDla+DC扩增倍数分别为(198±178)倍和(122±129)倍,与GT方案比较无统计学意义,但诱导细胞CD1a、CD80、CD86的表达明显高于后者.一步法扩增诱导2周时总细胞数扩增(43±16)倍,CD1a+DC数是0 d接种细胞的(4±2)倍.结论两步法能从正常CD34+细胞诱导产生大量DC,GI方案优于GT方案.两者扩增效率均优于一步法.     

响应面优化多细胞因子联合诱导分离树突状细胞的工艺北大核心CSCD

目的优化多细胞因子联合诱导分离树突状细胞(DC)工艺,提高小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)体外诱导分离效率。方法采用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)、脂多糖(LPS)、重组小鼠肿瘤坏死因子α(rmTNF-α)和诱导时间为考察因素,未成熟树突状细胞(imDC)和成熟树突状细胞(mDC)获得量为考察指标,采用Box-Behnken设计试验,响应面法分析并验证试验结果,并结合光学显微镜、电子显微镜、流式细胞术分析BMDC形态、表面标志物等指标。结果响应面优化诱导imDC最佳诱导工艺rmGM-CSF为46 ng/mL、rmIL-4为24 ng/mL,诱导时间为6 d;imDC获取量为(4.58±0.28)×10~6个,相对偏差为4.00%。诱导mDC最佳工艺LPS为1.4μg/m L、rmTNF-α为30 ng/m L,诱导时间为1 d;m DC获取量为(4.21±0.15)×10~6个,相对偏差为3.80%。体外诱导5~7 d,可获得足量的具有典型树突状的DC,流式细胞术检测发现imDC较高表达CD11c(68.62%±2.3%),低表达CD86(37.95%±1.8%);mDC高表达CD11c(82.05%±1.6%)和CD86(90.34%±1.4%)。结论单因素实验与响应面优化联合优化多细胞因子体外快速、高效诱导扩增DC,为进一步研究提供了工具。