人眼小梁细胞体外培养与细胞鉴定

建立人眼小梁细胞体外培养方法和确定该细胞的鉴定要点。方法：小梁网和我巩膜组织来源于除眼部疾患以外各种原因死亡的６岁以下儿童，在２４小时内取材的３４人６８只正常眼球。组织块原代培养和细胞传代培养。用光镜和电镜观察培养细胞，用免疫组织细胞化学Ｓ－Ｐ法染色培养细胞的细胞外基质包括纤粘连蛋白，层粘连蛋白和Ⅳ型胶原。     

人眼小梁细胞培养及免疫组化特性研究

目的 在体外进行人眼小梁细胞培养，以探索成功的培养方法。对培养的小梁细胞进行免疫组化特性研究，探讨小梁细胞的胚胎来源和生物学特性基础。方法 细胞培养使用ＤＭＥＭ培养基，ＣＯ２孵箱３７℃下培育。原代培养加用２０％胎牛血清，或增加１０％人ＡＢ血清。第１次传代在原培养瓶中进行。小梁细胞免疫组化Ｓ－Ｐ法染色确定其免疫组化特性。结果 人眼小梁细胞原代生长缓慢，成功率低。免疫组化结果显示：小梁细胞神经原特异性     

压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的 观察压力对小梁细胞的影响。方法 对体外培养牛眼小梁细胞施以不同程度的压力,用倒置相差显微镜、光镜、电镜观察细胞形态结构及吞噬功能的变化。结果 细胞承受２．００ｋｐａ（１ｋｐａ＝７．５ｍｍＨｇ）、２．６７ｋｐａ压力４８小时,各项指标与对照组比较,差异无显著性。４．００ｋｐａ２４小时,细胞形态结构有轻度的损伤,吞噬功能有轻度下降。当压力进一步增加,时间更加延长后,细胞的损伤也更重。结论小梁细胞只     

茶碱对培养的牛眼小梁细胞骨架及细胞间黏附的影响

目的 观察茶碱对培养的牛眼小梁细胞的增殖、细胞骨架、细胞间黏附的影响，探讨其降眼压机制。方法 组织块法培养牛眼小梁细胞。不同浓度的茶碱(1、10、50mmol／L)分别作用4h、8h，免疫细胞化学法观察小梁细胞微丝及微管的改变，MTT法观察小梁细胞的增殖。ELISA法检测不同浓度的茶碱作用4h后连接素(β-catenin)的相对表达量。结果 茶碱作用8h抑制细胞增殖。茶碱明显改变细胞形态、微管及微丝染色浓集，变化程度与药物浓度及作用时间有关。茶碱降低连接素的表达量。结论 茶碱抑制小梁细胞增殖，改变细胞骨架，降低细胞间黏附，提示茶碱可能通过影响细胞骨架及细胞间黏附减少房水流出阻力从而降低眼压。     

Tranilast抑制TGF-β2对人眼小梁细胞胶原合成的促进作用

目的 :观察tranilast对转化生长因子 -β2 (Transforminggwowthfactor -β2 ,TGF -β2 )促进体外培养人眼小梁细胞胶原合成作用的影响。方法 :采用3 H -脯氨酸掺入及液体闪烁测量技术观察 0 μg·ml-1(对照组 )、 12 5 μg·ml-1、 2 5 μg·ml-1和 5 0 μg·ml-1tranilast对3 2ng·ml-1TGF -β2 促进体外培养人眼小梁细胞胶原合成作用的影响。结果 :12 5 μg·ml-1(q′ =4 2 6,P <0 0 5 )tranilast处理组3 H -脯氨酸掺入量为 62 0 3 3± 80 46,与对照组的 817 3 7± 12 4 2 1比较有显著差异 ;2 5 μg·ml-1(q′ =4 81,P <0 0 1)和 5 0 μg·ml-1(q′ =8 62 ,P <0 0 1)tranilast处理组3 H -脯氨酸掺入量为5 94 5 8± 88 13、 418 64± 67 90 ,与对照组比较有极显著差异 ;同时 ,3 H -脯氨酸掺入量随tranilast浓度增加而减少 ,呈现明显的量效关系。结论 :Tranilast明显抑制TGF -β2 对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的促进作用。利用tranilast防治原发开角型青光眼的可能性值得作进一步研究。     

增殖细胞核抗原在人眼小梁细胞增殖研究中的应用

目的 探讨增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ,ＰＣＮＡ）在细胞增殖研究中的应用价值。方法 利用免疫组化方法对不同生长期（１２小时至２０天）的人眼第四代小梁细胞ＰＣＮＡ表达状况进行研究,并观察在不同浓度肾上腺素、地塞米松及表皮生长因子作用下ＰＣＮＡ的表达水平,并与正常细胞ＰＣＮＡ的表达水平对比研究,借助计算机图像处理系统对结果进行分析。结果 根据正常     

人眼小梁细胞体外表达表皮生长因子mRNA和表皮生长因子受体

目的 了解培养的小梁细胞分泌表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＥＧＦ）及细胞膜上表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＥＧＦＲ）的情况。方法 进行人眼小梁细胞体外培养。用ＥＧＦ ｃＤＡＮ探针,α＾－３２ｐ同位素标记及斑点杂交放射自显影法,检测小梁细胞分泌ＥＧＦｍＲＮＡ的情况。结果 人眼小梁细胞体外培养成功。免疫组化染色显示小     

反义CD44基因转染对人眼小梁细胞合成细胞外基质的影响

目的：观察反义CD44基因转染对人眼小梁细胞合成细胞外基质的影响,探讨黏附分子CD44在原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)发病过程中可能的作用。 方法：采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸,通过脂质体介导转染体外培养的人眼小梁细胞,免疫组织化学染色观察CD44反义寡核苷酸对小梁细胞合成胶原蛋白Ⅰ型、层黏附蛋白的影响,放射免疫法观察CD44反义寡核苷酸对小梁细胞合成透明质酸的影响。 结果：CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞合成胶原蛋白Ⅰ型、层黏附蛋白起促进作用,且呈浓度依赖性,浓度越高促分泌作用越强,但对小梁细胞合成透明质酸起抑制作用,浓度越高抑制作用越明显。 结论：CD44反义寡核苷酸封闭CD44基因表达后人眼小梁细胞合成胶原蛋白Ⅰ型、层黏附蛋白增加而合成透明质酸减少。黏附分子CD44可能通过影响小梁细胞合成细胞外基质功能参与了POAG发病过程。     

米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白表达的影响

目的　探讨糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白(fibronectin ,FN)表达的影响。方法　按组织块培养法进行人眼 (8只眼 )小梁细胞体外培养 ,在传 3代的小梁细胞培养液中分别先后加入不同浓度的地塞米松和米非司酮 ,应用免疫组织化学联合计算机图像分析的方法 ,检测细胞外染色区域的吸光度 (A值 )。结果　根据培养细胞的生长特性和形态特征及细胞外基质染色特点等 ,确定培养的细胞为人眼小梁细胞。含有不同浓度地塞米松和米非司酮的小梁细胞培养组与对照组比较 ,FN变化所对应的A值排列顺序为 :1 0 - 6 mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) >对照组≈ 1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) +1 0 - 8mol/L米非司酮 (7d)。结论　地塞米松能促进体外培养的人眼小梁细胞分泌与合成FN(A值升高 ) ,米非司酮可在受体水平拮抗并逐步逆转地塞米松引起的小梁细胞外FN的过度表达 (A值下降 )。糖皮质激素受体 (glucocorticoidrecepter,GR)拮抗剂米非司酮的降眼压作用尚有待在体内环境得到证实     

CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞增生与凋亡的影响

目的观察CD44反义寡核苷酸封闭CD44基因表达对人眼小梁细胞增生与凋亡的影响,探讨黏附分子CD44在原发性开角型青光眼发病过程中可能的作用。方法采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸,通过脂质体介导转染体外培养的人眼小梁细胞。MTT法观察CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞增生的影响。流式细胞仪检测CD44反义寡核苷酸封闭CD44基因表达对人眼小梁细胞凋亡的影响。结果3种浓度的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞的增生起抑制作用且呈浓度依赖性,浓度越高抑制作用越强,但对小梁细胞的凋亡起促进作用,浓度越高促凋亡作用越明显。结论CD44反义寡核苷酸封闭CD44基因表达后人眼小梁细胞增生作用受到抑制,小梁细胞的凋亡增加。黏附分子CD44可能通过影响小梁细胞的增生与凋亡过程参与了原发性开角型青光眼发病过程。     

Tranilast对人眼小梁细胞胶原合成的抑制

目的 观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。方法 体外培养第3～5代牛眼小梁细胞经0μg/ml(对照组)、12.5、25和50μg/ml tranilast处理后,采用~3H-脯氨酸掺入及液体闪烁测量技术观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。结果 12.5、25和50μg/ml tranilast处理组~3H-脯氨酸掺入率分别为(187±21)％,(127±18)％,(66±12)％,与对照组的(317±48)％比较有极显著差异;同时,~3H-脯氨酸掺入率随tranilast质量浓度增加而减少,呈剂量依赖性。结论 tranilast明显抑制小梁细胞胶原的合成。利用tranilast防治原发性开角型青光眼的可能性值得进一步研究。     

白细胞介素-1α对培养的人眼小梁细胞吞噬功能的影响

目的观察白细胞介素-1α（IL-1α）对体外培养的人眼小梁细胞（HTM）吞噬功能的影响。方法取人眼小梁组织进行小梁细胞体外培养,取传3～5代的人眼小梁细胞,加入不同浓度的IL-1α的DMEM-F12培养液,用倒置相差显微镜、光镜、电镜观察细胞吞噬功能的变化。结果小梁细胞吞噬乳胶微球数与IL-1α浓度（F=3．603,P=0．046）和作用时间（F=15．846,P=0．005）均有相关性（F=18．069,P=0．000）。结论IL-1α可以直接损害体外培养的人眼小梁细胞吞噬功能,其吞噬程度与IL-1α作用时间和浓度相关。     

选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养

目的选择性行牛眼上皮样小梁细胞的体外培养，为进一步研究原发性开角型青光眼提供实验材料。方法利用组织块法进行小梁细胞的原代培养，之后利用机械划除法、酶消化法、反复贴壁法，对牛眼上皮样小梁细胞进行选择性培养和传代。结果成功选择性培养出形态、性状良好的牛眼上皮样小梁细胞。结论选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养所获细胞形态单一，可以用此种方法进行牛小梁细胞的体外培养并为实验应用做好准备。     

米非司酮对培养的牛眼小梁细胞糖胺多糖代谢的影响

为了从发病学角度研究和发掘治疗青光眼的药物，在体外培养新生牛小梁细胞至第３代，掺入米非司酮（１１β－Ｉ４－（Ｎ，Ｎ－二甲胺基）苯基Ｊ－４，９－雌甾二烯－１７ａ－（１－丙炔）－１７β－羟基－３－酮，以下按国际贯例简称ＲＵ４８６）５０、１００、２００、４００ｕｇ／ｍｌ培养液和３Ｈ－葡萄糖胺，分离提纯后用乙酸纤维薄膜电泳、酶分解及液体闪烁等于手段测定生成的糖胺多糖（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，     

地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的研究

目的：探讨地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的机制。方法：采取体外组织块培养法,培养新生牛眼小梁细胞。将1－500mg/L地塞米松加入融合的第3－5代小梁细胞培养液中,作用1－14d,用相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、DNA电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：125－500mg/L地塞米松作用1－14d,小梁细胞凋亡呈浓度时间依赖性。 凋亡的小梁细胞经Hoechst3258染色,于荧光显微镜下观察,细胞核呈致密度浓染的颗粒块状荧光;透射电镜下可见小梁细胞染色质固缩,并有凋亡小体,细胞器基本完好;DNA电泳呈梯状条带,流式细胞仪测到亚二倍体峰。结论：地塞米松可诱导体外培养的小梁细胞凋亡,可能是激素性青光眼的发病机制之一。     

消化法牛眼小梁细胞的体外培养

目的 探讨用消化培养法体外培养牛眼小梁细胞，为进一步研究原发性开角型青光眼(POAG)提供实验材料。方法 0．25％胰蛋白酶、0．3％胶原酶等量混合行牛眼小梁细胞的原代培养和传代实验。结果 成功培养出性状良好的牛眼小梁细胞。结论 消化法培养牛眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞，是值得提倡的培养方法。     

葡萄糖对POAG患者小梁网细胞凋亡的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对POAG患者小梁网细胞凋亡的影响,研究葡萄糖与POAG以及糖尿病与POAG之间的关系,进一步探讨POAG的发病机制。方法实验研究。采用组织块培养法原代培养POAG患者小梁网细胞,取传代的小梁网细胞分别加入含葡萄糖终浓度为0.0（对照组）、5.5、45.0 mmol/L的无血清培养基,分别培养48 h后,采用CCK-8和流式细胞仪法检测不同浓度葡萄糖对小梁网细胞的影响。数据采用单因素方差进行分析。结果通过CCK-8检测发现,随着浓度的增加,葡萄糖对小梁网细胞的增殖抑制作用增强,可促进细胞凋亡,且各实验组与对照组之间相比差异有统计学意义（F=13.87,P＜0.01）;通过流式细胞仪法检测葡萄糖浓度为5.5、45.0 mmol/L实验组小梁网细胞凋亡率分别为10.65%±0.03%、25.74%±0.02%,均高于对照组（4.02%±0.03%）,且差异有统计学意义（F=25.34,P＜0.01）。结论高糖可以使小梁网细胞的增殖能力下降,凋亡率增加,从而可能导致小梁网细胞网状结构改变,房水流出途径的阻力增加。     

曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞转化生长因子-β2表达的抑制作用

目的　观察曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞转化生长因子 β2 (TGF β2 )表达的影响。方法　体外培养的第 3～ 5代人眼小梁细胞经 0 0 (对照组 )、12 5、2 5 0及 5 0 0mg/L曲尼司特处理 4 8h后 ,采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)观察曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞TGF β2 表达的影响 ,以人甘油醛 3 磷酸酯脱氢酶 (G3PDH)作为内参照。结果　 12 5、2 5 0及 5 0 0mg/L曲尼司特处理组TGF β2 /G3PDH象素值比值分别为 1 85± 0 35 ,1 6 6± 0 4 2 ,1 16± 0 2 4 ,与对照组比值 3 82± 0 5 6比较 ,差异有非常显著意义 (q′ =10 77,11 80 ,14 5 4 ;P <0 0 1) ;同时 ,TGF β2 /G3PDH比值随曲尼司特浓度增加而变小 ,呈现明显的量效关系。结论　曲尼司特能明显抑制小梁细胞TGF β2 的表达。可从发病学途径探讨曲尼司特对原发性开角型青光眼的治疗机制。     

可溶性CD44分子对原发性开角型青光眼患者小梁网细胞凋亡的影响

目的 探讨不同浓度的可溶性CD44分子(soluble CD44,sCD44)对原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)患者小梁网细胞凋亡的影响,以及研究sCD44与POAG发病的关系.方法 采用组织块培养法原代培养POAG患者小梁网细胞,取传3代的小梁网细胞分别加入含sCD44终浓度为0ng/ml(对照组),l ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,25 ng/ml,50 ng/ml的无血清培养基,分别培养24h后收集细胞,采用CCK-8法、荧光显微镜和流式细胞仪法,研究sCD44对POAG患者小梁网细胞凋亡的影响.结果 通过CCK-8法检测发现:随着sCD44终浓度的增加,sCD44对POAG患者小梁网细胞的抑制作用增强,且各实验组与对照组及各实验组之间相比差异有统计学意义(P＜0.05);通过荧光显微镜观察显示随着sCD44终浓度的增加,早期和晚期凋亡细胞明显增多;通过流式细胞仪法检测sCI44终浓度为l ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,25 ng/ml,50 ng/ml实验组小梁网细胞凋亡率分别为10.73±0.02,17.33±0.03,21.15±0.02,25.13±0.03,30.00±0.03,均高于对照组小梁网细胞凋亡率2.56±0.02,且各实验组与对照组及各实验组之间相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 sCD44在一定浓度范围内可以抑制POAG患者小梁网细胞的增殖,促进细胞的凋亡,并且呈现一定的剂量依赖性,sCD44可能通过作用于小梁网细胞间接参与POAG的发病过程.