全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要.目的:以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成.材料:SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增.取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红○染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力.结果:与密度梯度离心法相比,全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合索家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红○染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性.结论:采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法.经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.     

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力☆

背景:分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提. 目的:观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征. 方法:选取体质量为80-100 g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞.在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40 min以内.使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量. 结果与结论:原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期:潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示:CD29+99.45%、CD34+1.45%、CD44+99.52%、CD45+1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色.说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准.     

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力

背景：分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的：观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法：选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论：原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期：潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示：CD29＋99.45%、CD34＋1.45%、CD44＋99.52%、CD45＋1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。     

小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究

本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC）,鉴定其生物学特性和多向分化潜能。取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞,采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC;分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期;进行多向分化潜能鉴定;传代培养达30代后,进行成瘤性检测。结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代,细胞仍保持多向分化潜能,细胞高表达CD29、CD44、Sca-1、MHC-Ⅰ,中度表达CD13、CD90.2,不表达CD117、CD45、Flk-1、MHC-Ⅱ类抗原。mMSC体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC,其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定,具有高度的增殖和多向分化潜能,无成瘤性。     

大鼠骨髓MSCs表面分子检测及诱导分化研究

目的通过建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离培养方法，探讨大鼠MSCs表型特征以及多向分化潜能。方法利用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓MSCs，传代扩增，进行形态学观察，测定生长曲线。免疫细胞组织化学及流式细胞分析检测细胞表面分子的表达。定向诱导MSCs向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。结果原代分离的MSCs在接种后48h贴壁，细胞形态为椭圆形，多角形及短梭形，12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增，细胞进一步纯化，细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列，而且生长速率加快，Pl代细胞群体倍增时间为20．3h。细胞免疫组化结果显示P2代细胞表面分子CD44、FN表达阳性，而CD14、CD34阴性，流式细胞检测CD44、FN阳性率分别为92．09％和90．55％。不同诱导剂定向诱导2周，经油红O、阿新兰及茜素红S染色鉴定，P3代MSCs分别向脂肪细胞，软骨细胞及成骨细胞分化。结论通过密度梯度离心结合贴壁筛选方法，体外分离培养的大鼠骨髓MSCs具有很强的增殖能力，并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景:利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。目的:通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。方法:利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。结果与结论:原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白,与传统病毒、质粒转染相比,能在活细胞中稳定地表达,可较快筛选其修饰的细胞。目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型,并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化,采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达 CD90和CD105,不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积,经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,可作为良好的示踪因子。     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

本研究旨在建立一种方便、快捷、有效体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）的方法。在无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,分别用全骨髓贴壁法、骨片消化法、骨髓加骨片法分离小鼠MSC,比较Msc集落出现时间、大小及数量;应用流式细胞术检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定。结果表明,骨髓加骨片法出现的集落时间最早,集落数量最多,第4天集落数为20±4个;骨片消化法为11．5±2．5个;全骨髓贴壁法最少,为9．5±1．5个;到第3代时,骨髓加骨片法获得细胞数量最多,是全骨髓贴壁法和骨片消化法的2倍;流式细胞术检测结果显示,获得的细胞高表达干细胞标志之一Sca-1,高表达CDdd、CD29,不表达白细胞表面抗原CIM5和内皮细胞标志CD31等;所分离的MSC在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有典型的MSC特性。结论：骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSC分离方法。     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

急性白血病儿童骨髓间充质干细胞的生物学特点的初步研究

本研究探讨密度梯度离心法加贴壁法方式培养白血病儿童骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）的条件并观察其体外增殖能力、生长曲线、多向分化等生物学特性。通过密度梯度离心、贴壁法分离白血病患儿的MSC,观察细胞的形态变化及生长曲线、流式细胞术测定其CD29、CD105、CD45、CD34、CD14、HLA—DR等表达,通过成脂、成骨诱导研究其多向分化能力。结果表明：密度梯度离心法联合贴壁法可以培养出白血病儿童骨髓来源的MSC,初诊白血病儿童骨髓来源的MSC培养成功率为57．1％,缓解白血病儿童骨髓来源的MSC成功率为41．2％,接种密度越大成功率越高,初诊白血病儿童的MSC形成集落数目较多且生长较快。形态学观察显示,骨髓间充质干细胞接种24小时即贴壁,呈集落生长,形态多样;3天后贴壁细胞增殖,逐渐以梭形细胞为主;2—3周细胞基本达80％-90％融合,第3代后细胞呈均匀一致的长梭形。细胞传代后3天内处于潜伏期,3天后进入生长期,8天后进入平台期。检测第2代后细胞免疫表型显示,MSC的CD29、CD105表达率达95％以上,CIM5、CD34、CD14、HLA．DR极低表达或不表达。MSC能成功诱导成脂肪细胞及成骨细胞,油红O染色和茜素红染色为阳性。在合适的条件下冻存对细胞影响不大。结论：①白血病患儿骨髓培养出的贴壁细胞是MSC,骨髓含量在1ml以上且方法得当可以培养出MSC;②初诊的白血病患儿的骨髓相对容易培养出骨髓间充质干细胞,形成的集落较缓解期白血病患儿多,增长速度较快;⑧白血病儿童来源的MSC具有MSC的共同生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的探索体外培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcell,MSC）的方法,为人骨髓间充质干细胞移植于受损心脏、改善心脏功能的研究打下基础。方法采用Percoll（1．073g／ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液体外培养扩增骨髓MSC,并通过FCM对其纯度进行鉴定。结果Percoll液能成功分离出骨髓间充质干细胞。原代及传代培养显示人骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。体外扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD29、CD166等表面抗原,不表达CD34、CD45等表面抗原。结论人骨髓间充质干细胞作为一种具有多分化潜能的多能干细胞,具有强大的分裂增殖能力,体外培养无明显的分化倾向．     

Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞

背景：研究报道显示猪骨髓间充质干细胞体外分离方法、效率、培养条件各不相同,并且尚无统一的鉴定标准。目的：建立一种高效、经济的猪骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法。方法：采集健康猪股骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,进行原代和传代培养,流式细胞仪检测细胞膜表面抗原表达情况,并观察细胞成骨、成脂及成软骨分化的能力。结果与结论：分离培养的单个核细胞活力旺盛,体外生长良好,细胞呈梭形、纺锤形和小多角形,具有稳定的增殖分裂能力;细胞膜表面抗原CD29、CD44、CD90呈阳性表达,而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达;在特定诱导条件下,该细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。说明采用Ficoll密度梯度离心法成功分离培养出纯化的猪骨髓间充质干细胞,其生长状态良好,具有多项分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。