As_2O_3诱导急性淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞p15基因表达的研究

目的　探讨砷剂与甲基化的关系。方法　先用甲基化特异的PCR检测急性T淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞p15基因甲基化 ,然后用RT PCR方法检测用As2 O3 处理或未处理Molt4细胞的p15基因mRNA表达 ,用流式细胞仪检测细胞周期并绘制生长曲线。结果　Molt4细胞p15基因发生甲基化 ,p15mRNA不表达 ,Molt4细胞与As2 O3 一起培养后 ,p15基因mRNA重新表达 ,G0 G1 期细胞明显增多 ,Molt4细胞生长受到抑制。结论　As2 O3 能够去p15基因甲基化 ,激活p15基因的mRNA表达 ,恢复p15基因的细胞周期负调节功能。     

三氧化二砷诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1细胞p15INK4B基因表达的研究

目的 探讨三氧化二砷（As2O3)去甲基化作用的机制。方法 采用甲基化特异PCR（MSP）检测p15INK4B基因甲基化，RT－PCR方法检测p15，甲基转移酶（DNMT）1，DNMT3A，DNMT3B的表达，MTT法检测As2O3对MUTZ－1细胞的生长抑制。结果 MUTZ－1细胞有p15INK4B基因甲基化，p15基因弱表达，As2O3作用后p15INK4B基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，DNMT3A，DNMT3B mRNA的表达下降并呈浓度依赖性。结论 As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A，DNMT3B，或（和）直接对p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复共活性。     

As_2O_3对Jurkat细胞株hdpr1基因去甲基化作用机制的研究

本研究探讨三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株hdpr1抑癌基因去甲基化的影响及其作用机制。采用CCK8法检测As2O3对Jurkat细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测As2O3作用前后细胞周期的变化,甲基化特异性PCR（MSP）检测As2O3对hdpr1基因甲基化模式的影响,用半定量RT-PCR检测As2O3对hdpr1基因、DNA甲基转移酶基因dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA表达水平的影响。结果表明：As2O3可明显抑制Jurkat细胞的增殖并呈时间-浓度依赖性;As2O3阻滞Jurkat细胞周期于G0/G1期（p〈0.05）,呈浓度依赖性;As2O3能够逆转Jurkat细胞株hdpr1基因的高甲基化并诱导其mRNA重新表达,同时下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA的表达水平,亦呈浓度依赖性。结论：As2O3抑制Jurkat细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,其机制可能为下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b基因的表达,诱导Jurkat细胞中异常甲基化的hdpr1基因去甲基化并使其恢复表达。     

VPA和As2O3对Molt-4细胞的协同作用及可能机制

本研究探讨丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）单药或与亚砷酸（arsenie trioxide，As2O，3）联用对人急性T细胞白血病细胞株Molt-4增殖活力的抑制、去甲基化作用及其可能机制。用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用，利用金氏公式观察两药联用体外抗癌的协同作用。采用半巢式甲基化特异PCR（hnMS—PCR）检测p15INK4B基因甲基化，RT—PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMT3B的表达。结果表明：VPA和As2O3均可明显抑制细胞增殖，二者联用在体外有相加作用（Q值均大于0．85），在5mmol／LVPA与10μmol／LAs2O3联用时抑制率达（70．31±2．54）％。Molt-4细胞p15基因因高甲基化而失表达，经VPA和As2O3联合作用后p15基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，两药联用时DNMT-1、DNMT-3A、DNMT3B mRNA的表达都有下降。结论：VPA可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT-1和（或）DNMT3B使p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复其活性。VPA和As2O3均可明显抑制Mol-4细胞增殖，两药合用有协同相加作用，可减少砷剂的副作用。     

Raji细胞Id4基因甲基化检测及As2O3对其甲基化影响的研究

目的 研究淋巴瘤细胞DNA结合抑制因子4(inhibitor of DNA binding,Id4)基因甲基化及As2O3去甲基化效应.方法 体外培养人Burkitt's淋巴瘤细胞系Raji细胞,设对照组和用不同浓度As2O3处理Raji细胞不同时间的实验组.用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测各组Raji细胞Id4基因甲基化程度;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度As2O3处理前后Raji细胞Id4mRNA的表达情况.应用MTT比色法检测细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡并分析As2O3对细胞周期的影响.结果 ①Raji细胞Id4基因呈完全甲基化状态,Raji细胞Id4基因高甲基化状态可被As2O3逆转,且与As2O3的剂量有关.②不同浓度As2O3处理Raji细胞48 h后,随着药物浓度增加,Raji细胞中Id4基因mRNA的相对表达量逐渐增加,呈一定剂量依赖关系.③不同浓度As2O3处理Raji细胞24、48、72 h后细胞增殖抑制率为12.15%～92.17%,且作用呈时间剂量依赖性(P＜0.05);④FCM检测细胞凋亡结果显示,As2O3处理Raji细胞48 h后均出现明显的凋亡峰,对照组未见凋亡峰或仅有低平的凋亡峰;⑤FCM细胞周期分析结果显示,不同浓度As2O3处理Raji细胞48 h后,细胞阻滞于G0/G1期,且随着As2O3浓度的增加,阻滞作用增强,呈一定剂量依赖关系.结论 ①人Burkitt's淋巴瘤细胞系Raji细胞中Id4基因呈完全甲基化状态.②As2O3可以逆转Raji细胞Id4基因的高甲基化状态,使Id4 mRNA重新表达.③Raji细胞Id4基因呈高甲基化状态是其恶性增殖的原因之一.     

丙戊酸钠对Molt-4细胞增殖的影响及其作用途径探讨

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对人急性T细胞白血病细胞系Molt-4细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其对Molt-4细胞p15INK4B基因甲基化状态的影响.方法 不同浓度VPA作用Molt-4细胞后,用MTr法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期的变化,半巢式甲基化特异PCR(MSP)法检测p15INK4B基因甲基化状态,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMrT3B mRNA的表达.结果 VPA可明显抑制细胞增殖,影响Molt-4细胞周期分布,5.0mmol/L VPA作用Molt-4细胞48 h,G0/G1期细胞为(66.87±3.31)%,S期细胞为(8.47±2.56)%,与未加VPA组相比,S期细胞明显下降,G0/G1期细胞明显升高(P＜0.05).经VPA作用后Molt-4细胞p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达水平明显增加,DNMT-1、DNMT3B mRNA表达水平下降,以DNMT-1下降较明显.结论 VPA可能通过抑制甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B表达使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制Molt-4细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期.     

巢式MSP检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤U266细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究探讨用高灵敏度的DNA甲基化检测方法及DNA克隆测序分析法检测三氧化二砷(As2O3)的去甲基化作用,并对其可能的去甲基化作用机制进行分析。采用巢式甲基特异性PCR法(nested-methylation specificPCR,n-MSP)、DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后U266细胞株p16基因甲基化状态,应用RT-PCR检测p16、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达,以生长曲线、MTT法、集落形成实验检测As2O3对骨髓瘤细胞生长和增殖的抑制作用。利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对多发性骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果表明:①未处理组U266细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经As2O3作用的U266细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,这说明U266细胞存在p16基因甲基化,As2O3作用后p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因不表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/组和2.0μmol/组p16基因表达阳性条带灰度值与β-肌动蛋白比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09),阳性对照灰度比值为(0.77±0.13),差异有非常显著的统计学意义(P<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制骨髓瘤细胞生长,G0-G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B和(或)直接对p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,从而实现其对细胞周期的调控功能,将细胞阻滞于G0-G1期,抑制骨髓瘤细胞的增长。     

AS_2O_3逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制。以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象。采用SRB法检测As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果表明:①As2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长。     

表没食子儿茶素没食子酸诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究旨在探讨表没食子儿茶素没食子酯酸（epigallocatechin-3-gallate．EGCG）诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录激活的可能机制。以生长曲线、MTT法检测EGCG对CA46细胞生长和增殖的抑制作用；利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨EGCG对CA46细胞周期的影响；采用巢式甲基特异性PCR法（nested—methylation specific PCR，n-MSP）及DNA克隆测序分析法检测EGCG作用前后CA46细胞p16基因甲基化状态；应用RT—PCR检测p16、DNA甲基转移酶（DNMT3A、DNMT3B）基因mRNA的表达。结果表明：与对照组相比，3组不同浓度EGCG均能明显抑制CA46细胞生长，G0／G1期细胞增加；不同浓度EGCG作用48小时后p16基因甲基化程度减弱；未处理组细胞p16基因呈微弱表达，未用药组、不同浓度EGCG（6、12、24）μg／ml处理组条带灰度值与β-actinl比值分别为（0．05±0．01）、（0．19±0．03）、（O．39±0．10）、（0．85±0．09），各处理组p16基因mRNA表达明显高于未用药组，其差异有显著意义（P〈0．05）；与对照组相比，EGCG作用48小时后CA46细胞甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达均下降。结论：EGCG可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B和（或）直接对p16基因去甲基化，使p16基因mRNA表达上调，恢复其活性，从而实现其时细胞周期的调控功能，将细胞阻滞于G0／G1期，抑制CA46细胞的增殖     

砷剂诱导多发性骨髓瘤细胞socs-1基因去甲基化作用的研究

本研究探讨三氧化二砷（As2O3）对人多发性骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226细胞内socs-基因甲基化状态的影响。用MTT法观察As2O3对骨髓瘤细胞增殖情况的影响，采用甲基特异性PCR法检测As2O3作用前后骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226 socs-1基因的甲基化状态，以实时定量PCR技术定量检测细胞株给药前后socs-1基因mRNA的表达变化，流式细胞技术检测As2O3诱导的骨髓瘤细胞的凋亡情况。结果表明：人骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226均存在不同程度的socs-1基因CpG岛甲基化，socs-1基因不表达的现象。As2O3作用72小时后socs-1基因甲基化程度明显减弱或消失，socs—1基因在mRNA水平上表达明显增强，与各野生型细胞株相比，差异具有显著性P〈0．05），且细胞生长抑制明显，早期、晚期细胞凋亡比率明显升高，并呈现剂量依赖性。结论：As：03可诱导socs—1基因甲基化状态的改变，使基因表达上调，恢复其活性，这为进一步阐明As2O3诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制和As2O3治疗多发性骨髓瘤的可能机制提供新的思路和新的研究方向。     

As2O3对KM3细胞端粒酶及其逆转录酶作用的研究

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3的作用及其可能机制，用台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制率，用光镜、透射电镜观察形态变化，用DNA电泳观察As2O3诱导KM3细胞凋亡，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用TRAP-PCR-EUSA法检测As2O3作用KM3细胞后的端粒酶活性变化，并用半定量RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERTmRNA)的表达水平。结果表明：As2O3抑制KM3细胞的生长，具有诱导细胞凋亡的作用；As2O3阻滞细胞于G2期；As2O3可抑制KM3细胞的端粒酶活性和hTERTmRNA的表达，且hTERTmRNA下降趋势与端粒酶活性相一致。结论：端粒酶及其逆转录酶活性的下调可能在As2O3诱导KM3细胞凋亡的过程中起了重要作用。     

三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡相关基因表达的影响

本研究采用微矩阵基因芯片技术探讨三氧化二砷（As2O3）对NB4细胞凋亡的相关基因表达谱的影响。As2O3作用NB4细胞48小时，用改进的TRlzOL试剂一步法抽提As2O3作用前后的NB4细胞总RNA；经逆转录．聚合酶链反应后用Cy3标记的脱氧三磷酸尿苷（Cy32dUTP）和Cy52dUTP两种不同的荧光染料，将As2O3作用前后的NB4细胞mRNA分别标记成两种DNA探针，并与载有一组凋亡相关基因的表达谱芯片进行杂交，扫描分析筛选As2O3作用前后NB4细胞表达差异的凋亡基因；采用逆转录实时定量聚舍酶链反应（RQ—PCR）检测p2l，survivin，cdc2及WeelHu等方法检测细胞凋亡。结果表明：从As2O3作用后NB4细胞中筛选出表达差异的凋亡相关基因共18条，包括p21，survivin，cdc2及WeelHu等，表达上调的有6条，表达下调有12条；p21、survivin、cdc2及WeelHu可能与As20，诱导NB-4细胞的分化和（或）凋亡有关。结论：As203介导的NB4细胞凋亡的发生机制中、p21、sur-vivin、cdc2及Weel可能发挥着重要作用。     

一定浓度下三氧化二砷对T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株增殖的影响

背景：近年来有将三氧化二砷试用于T细胞肿瘤的有效报道,但未见其治疗机制的相关研究。目的：检测三氧化二砷对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞的抑制增殖、诱导凋亡及细胞周期的影响。方法：分别采用MTT、PI单标记流式细胞术和TUNEL法检测2,5,10μmol/L的三氧化二砷干预24,48,72h,对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期的影响,及其凋亡相关基因bcl-2及血管内皮细胞生长因子基因表达的变化。结果与结论：在一定的浓度范围内,三氧化二砷对Hut-78细胞存在增殖抑制作用,其增殖抑制作用在一定程度上可能与下调血管内皮细胞生长因子基因的表达有关,同时还存在一定的细胞毒作用;三氧化二砷可诱导Hut-78细胞发生凋亡,凋亡机制主要发生在G2～M期,其凋亡作用可能与下调bcl-2基因表达有关。三氧化二砷对Hut-78细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用呈时间剂量依赖性。     

亚砷酸联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导人淋巴瘤细胞Raji凋亡的研究

本研究探索亚砷酸、硼替佐米对人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的协同诱导凋亡作用。小剂量亚砷酸、硼替佐米单用以及二者联合分别处理Raji细胞，用台盼蓝拒染法计数活细胞数和细胞生长抑制率；用流式细胞术分析细胞凋亡和周期的变化；以Western blot检测Caspase-3、BCL-2、BAX、JNK2、IκB-α等凋亡相关元件在蛋白水平的变化。结果表明：相比于单用亚砷酸和硼替佐米，以小剂量亚砷酸联合硼替佐米处理Raji细胞后，细胞生长受明显抑制（P〈0．01），细胞凋亡比例增加（P=0.001），但细胞周期未见明显阻滞；在蛋白水平，细胞凋亡相关元件Caspase-3、BAX和IκB-α表达增加，而BCL-2和JNK2表达量下降。结论：小剂量亚砷酸联合硼替佐米能更有效地诱导Raji细胞凋亡，并具有协同作用。该作用可能是通过抑制NF—κB和JNK2通路实现的。