大肠杆菌碱性磷酸酶在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达

目的 构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础.方法 以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力.结果 经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90％以上,酶比活力可达358.6 U/mg.结论 成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础.     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

侵袭性大肠埃希菌IpaC的表达和纯化与检验学研究

目的研究分析侵袭性大肠埃希茵的发病机制,表达和纯化侵袭性大肠埃希茵毒力蛋白IpaC与临床意义。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionitsTM蛋白纯化系统纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63 kD的条带,其含量约占总蛋白量的13%,对目的蛋白进行纯化后发现,以400 mmol/L咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想,纯度可达90%以上。结论 pET32a-ipaC重组表达质粒转化大肠杆菌B121(λDE3),可稳定、高效地表达目的蛋白;QIAexpressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

C1q/TNFα相关蛋白-1功能区的表达、纯化及生物活性分析

目的:利用大肠杆菌表达可溶性hCTRP1球状功能区蛋白并分析其生物活性。方法:重组质粒转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)菌株、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达并纯化。结果:hCTRP1球状区蛋白实现在大肠杆菌中的高水平表达,利用镍亲合纯化和分子筛纯化到重组蛋白,重组蛋白在细胞和动物水平上都具有生物活性。结论:利用大肠杆菌表达系统高效制备了具有生物活性的hCTRP1球状功能区蛋白。     

抗栓肽基因的克隆和表达

抗栓肽(Decorsin)是糖蛋白Ⅱb-Ⅲa(GPⅡb-Ⅲa)的强拮抗剂,能抑制血小板聚集。实验通过设计两对引物,经PCR获得抗栓肽的结构基因,并将基因插入原核表达载体pET32a硫氧还蛋白(TrxA)的下游。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,表达产物以可溶形式存在于胞内,占菌体总蛋白的35%。利用表达载体自身所带的His×6纯化标签,可将融合蛋白通过金属螯合亲和层析柱一步纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析达到电泳纯。体外的抑制血小板聚集实验结果表明,融合蛋白具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集活性,抑制常数IC50为500 nmol/L。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

重组质粒Eg.EF-1/pGEX-6P-1的构建及原核诱导表达

将细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,Eg.）延伸因子（Elongation factor 1,EF-1）与pGEX-6P-1构建成重组质粒并进行表达、纯化及对其特性进行鉴定.将构建好的EF-1/pGEM-T经双酶切后获取目的基因片段,定向重组于表达载体pGEX-6P-1并转化大肠杆菌（Escherichia coli）E.coli BL21,IPTG诱导表达,用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,特异性蛋白解离酶PreScission^TM Protease酶切融合蛋白从中获取重组Eg.EF-1;SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物.获得的Eg.EF-1/pGEX-6P-1/E.coli BL21菌株,诱导表达融合蛋白和纯化分离得到的31 ku Eg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别.证明成功构建出具有有效表达的Eg.EF-1/pGEX-6P-1菌株,初步证实重组蛋白具有较好的抗原性.     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究

目的人单酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一类促进脂肪分解成甘油和脂肪酸的丝氨酸水解酶,是抗肿瘤药物研发的新靶点。为了建立高通量的MAGL抑制剂筛选模型,本研究对人MAGL进行了基因克隆、体外重组表达、纯化以及活性研究。方法通过RT-PCR方法从人脑总RNA中扩增人MAGL基因,并将该基因克隆入pET28a(+)表达载体。将重组蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通过1mmol/L IPTG诱导表达。表达产物用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行分离纯化,通过SDS-PAGE进行分析。以7-hydroxycoumarinyl arachidonate(7-HAC)为荧光底物进行酶的活性测定。结果成功扩增出人MAGL基因,并构建了pET28a-MAGL表达载体。SDS-PAGE检测结果表明重组人MAGL蛋白在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的25%,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化后的重组蛋白纯度大于90%,其比活力达到7900IU/mg,,较纯化前提高了23倍。酶活性分析结果证明重组表达并纯化的蛋白具有单酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑制剂N-arachidonylmaleimide(NAM)对该酶表现出强的抑制活性,IC50值为0.53μmol/L。结论本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了人单酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶点的抗肿瘤药物筛选模型奠定了基础。     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

GST-hS100A9融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的制备GST-hS100A9融合蛋白。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增获取hS100A9基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-hS100A9;后者转化BL21菌后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达融合蛋白GST-hS100A9,经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(GS4BB)分离纯化、SDS-PAGE及Western blot鉴定,BCA法蛋白定量,CCK-8测定GST-hS100A9对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。结果经酶切、测序分析证实pGST-hS100A9质粒构建正确;重组菌株经IPTG诱导后,表达相对分子质量约36 000的蛋白;纯化后纯度达94%;该蛋白可被S100A9的抗体特异识别;该蛋白产量约为20 mg/L菌液;且其抑制MCF-7的增殖。结论成功构建GST-hS100A9融合蛋白的原核表达质粒pGST-hS100A9;该质粒可在BL21中诱导表达GST-hS100A9,产率高,且对MCF-7增殖有抑制作用。     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定

本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。     

HIV核衣壳蛋白p24在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

目的 用基因工程方法获得HIVp24蛋白编码区基因片段,构建重组质粒,并在大肠杆菌中高效表达目的 蛋白. 方法 设计带有酶切位点的引物,扩增p24基因,分别连接到pET-11c和pET-16b载体上,将两种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达.选择离子交换层析和分子筛层析纯化p24. 结果 p24在大肠杆菌中高效表达,p24在非还原性电泳中呈单一条带,提示有较好的立体结构,p24-pET-16b的表达量占到总蛋白表达量的30%.经纯化后蛋白纯度达到90%以上.  结论 p24能在大肠杆菌中高效表达.     

人TNFβ缺失体融合表达及其产物一步纯化法研究

本文将h TNFβN端缺失23aa的缺失体基因克隆于pET-28-C(+)表达载体,构建成T7lac启动子控制下His6-TNFβ融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,His6-TNFβ表达量约占总菌体蛋白的25%,Mr 20500.表达产物大部分以包涵体形式存在.包涵体经过洗涤,70mol/L脲变性溶解,用Ni2+亲和层析一步快速纯化,所得His6-TNFβ的纯度达90%以上,回收率在90%左右.纯化产物稀释复性后,其细胞毒活性为(0.5～1.0)×106U/mg 蛋白左右.这些研究结果将为制备重组人TNFβ缺失体以及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCU C端截短21个氨基酸的.NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件.利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a( )-NSSB-C21,IFTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定.成功构建了HCV NSSB蛋白表达载体pET-28a( )-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5D-C21表达产物的可溶性明显增加.HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础.