缺氧后适应中蛋白激酶Cε与钙敏感受体相互作用对乳鼠心肌细胞的保护作用

目的:研究缺氧后适应中蛋白激酶Cε(PKCε)与钙敏感受体(CaR)相互作用对乳鼠心肌细胞的保护作用.方法:Wistar乳鼠(出生后3-7 d)心肌细胞培养3-5 d,随机分为7组:正常对照组(N组),缺氧/复氧组(H/Re组),缺氧后适应组(HPC组),GdCl3组(GdCl3,NiCl2,CdCl2组),caffeine组(caffeine, GdCl3,NiCl2,CdCl2组),PKCε抑制剂组(PKCI组)和PKCI+GdCl3组 (PKCI,GdCl3,NiCl2,CdCl2组).采用饱和氮气pH6.8的D-Hanks液和含20%新生牛血清的DMEM液复制心肌缺氧/复氧模型.检测各组细胞存活率及各组乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)含量变化,Western blotting检测心肌细胞膜CaR和PKCε蛋白表达水平,免疫共沉淀检测细胞膜上CaR和PKCε的相互作用,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定心肌细胞内游离钙([Ca2+]i)的变化,TUNEL染色观察细胞凋亡.结果:H/Re、GdCl3和PKCI组的细胞存活率低于对照组和HPC组;反之,LDH活力和MDA含量高于对照组和HPC组.同时,在GdCl3、caffeine和PKCI+ GdCl3组CaR的蛋白表达水平较HPC和PKCI组增高,且[Ca2+]i和细胞凋亡率也高于后2组;而PKCI和PKCI+ GdCl3组PKCε蛋白表达水平低于H/Re、HPC、GdCl3和caffeine组.免疫共沉淀检测到CaR和PKCε在细胞膜上发生相互作用.结论:在乳鼠心肌细胞缺氧后适应中,PKCε已转位到细胞膜和CaR相互作用,此相互作用能减少[Ca2+]i,对缺氧的乳鼠心肌细胞在进行复氧时产生保护作用.     

钙敏感受体在缺氧-复氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的： 观察大鼠心肌钙敏感受体(CaSR) 在心肌缺氧/再灌注损伤时的表达情况及其介导的细胞内钙变化，以及其参与细胞凋亡的相关信号转导途径。方法： Lagendorff离体灌流方法复制心脏缺氧-复氧（anoxia-reoxygenation，A/R）模型；观察缺氧/再灌注及加入CaSR激动剂时CaSR的表达；应用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察大鼠心肌细胞正常、缺氧、缺氧/再灌注时［Ca2+］i变化；HE染色观察细胞形态学改变；TUNEL染色观察细胞凋亡； Western blotting检测心肌组织胞浆中caspase 3、caspase 9 的表达。结果： 心肌A/R组及加入CaSR激动剂时CaSR的表达明显增高，细胞内钙明显升高。HE染色发现A/R组和激动剂组损伤明显，TUNEL显示2组凋亡细胞大量存在。同时，A/R组和激动剂组胞浆中caspase 3和caspase 9的表达增加。结论： CaSR参与大鼠心肌A/R损伤时细胞内钙超载的形成，并促进A/R损伤时心肌细胞凋亡。     

钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。应用Western blotting技术及免疫荧光染色分析CaSR蛋白在肺动脉平滑肌的表达;采用激光共聚焦扫描技术检测不同处理因素对细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,应用MTT法分析不同处理因素对细胞存活率的影响。结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞有CaSR蛋白表达。缺氧能够增加CaSR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞存活率及[Ca2+]i(与对照组比较,P0.05)。GdCl3(CaSR激动剂)能够增强缺氧的上述作用,NPS2390(CaSR抑制剂)则能够减弱缺氧的作用。结论:缺氧诱导的CaSR表达增加参与了缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖。     

钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用

目的：观察钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用。方法:乳鼠原代心肌细胞培养4-5 d后，随机分为5组:正常对照组（N组）、缺氧/复氧组（H/Re组）、阻断剂（NiCl2,CdCl2）组、激动剂（GdCl3,NiCl2,CdCl2）组和caffeine组。采用饱和氮气pH6.8的D-Hands液培养细胞3 h，再用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞9 h，复制心肌缺氧/复氧模型。检测血清LDH活力，MTT检测细胞存活率，心肌细胞caspase-12和CaSR 蛋白表达水平Western blotting检测, 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定心肌细胞内游离钙的变化。结果:缺氧/复氧组和激动剂组LDH活力、细胞内游离钙浓度均高于对照组;同时，caspase-12和CaSR的表达也明显高于对照组。反之，细胞存活率低于对照组。结论:心肌缺氧/复氧过程中，钙敏感受体表达增多,从而破坏了细胞内钙稳态诱发过度的内质网应激,通过caspase-12等凋亡蛋白表达的增多等途径引起心肌细胞凋亡。     

TNF-α和钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠心肌缺血后适应中的作用

目的: 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肌浆网钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在大鼠心肌缺血后适应发生机制中的作用。方法: SD大鼠随机分为5组(各组n=16),包括假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血后适应组(IP组)、重组人肿瘤坏死因子受体:Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)+缺血再灌注组(F+IR组)和rhTNFR:Fc+缺血后适应组(F+IP组)。结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤和缺血后适应模型,测量各组心肌梗死面积;RT-PCR及Western blotting测定心肌TNF-α mRNA和蛋白及CaMKⅡ含量和活性。结果: (1)与sham组比较,IR组梗死面积/缺血区面积及缺血区面积/总面积的比值均显著增加(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组这2个比值均显著减少(P<0.01),其中F+IP组减少更为明显。(2) 与sham组比较,其余各组心肌组织TNF-α mRNA和蛋白均显著升高(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组TNF-α表达均显著降低(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMK Ⅱ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著。(4)与sham组比较,IR组和IP组肌浆网CaMKⅡ活性显著降低(P<0.01),而F+IR组和F+IP组均明显升高;与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMKⅡ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著。结论: 缺血后适应可通过降低缺血再灌注时心肌组织TNF-α mRNA和蛋白表达、增加CaMKⅡ含量和活性发挥心肌保护作用。     

钙敏感受体通过PI3K信号通路介导缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的:探讨钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖中的信号转导途径。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠PASMCs。通过缺氧培养箱内(93%N₂、2%O₂、5%CO₂)培养24h的方法复制细胞缺氧模型。应用Western blotting分析不同处理情况下细胞周期素D1(cyclin D1)及磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)在PASMCs中的表达;采用流式细胞术检测不同处理因素对细胞增殖周期及增殖指数的影响,应用BrdU掺入法分析不同处理因素对细胞DNA合成的影响。结果:缺氧引起PASMCs的cyclin D1及p-Akt表达水平上调,增加BrdU掺入量、S期细胞数量和细胞增殖指数,GdCl₃能够放大缺氧的作用,但上述效应可以被LY294002抑制。结论:CaSR通过PI3K/Akt信号通路参与缺氧诱导的大鼠PASMCs增殖。     

甘氨酸受体在甘氨酸抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究

目的：探讨甘氨酸受体在心脏保护中的作用及甘氨酸受体的性质。方法：利用原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞建立心肌缺氧/复氧(A/R)模型，并用甘氨酸受体阻断法和消除细胞外氯离子法, 测定各组培养心肌细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）的含量、钙离子浓度和心肌细胞凋亡率。结果：A/R组用甘氨酸处理后SOD活性、NO含量升高，MDA含量、［Ca²⁺］_i、细胞凋亡率降低，与A/R组比较显著差异。分别用甘氨酸受体阻断剂士的宁和消除细胞外氯离子处理后，甘氨酸的上述保护作用明显减弱，与A/R组比较无显著差异。结论：甘氨酸能抑制缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的自由基生成、抑制钙超载，减轻心肌细胞的凋亡并增加细胞内SOD等保护蛋白和NO的合成而发挥细胞保护作用。甘氨酸的细胞保护作用可能是通过甘氨酸受体发挥作用的，甘氨酸受体的本质可能是甘氨酸门控氯离子通道。     

钙敏感受体通过PI3K/AKT通路对缺氧诱导的A549细胞增殖的影响

目的:探讨钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)在缺氧诱导的A549及A549/DDP细胞增殖中的信号转导途径。方法:通过缺氧培养箱内(93%N_2、2%O_2、5%CO_2)培养24 h的方法复制细胞缺氧模型。应用Western blot技术分析PCNA及p-AKT蛋白不同处理情况下的表达水平;采用流式细胞技术检测不同处理因素对细胞周期及增殖指数的影响,应用BrdU掺入法分析不同处理因素对细胞DNA合成的影响。结果:缺氧引起A549及A549/DDP细胞PCNA及p-AKT蛋白水平上调,增加BrdU掺入量、S期细胞数量和细胞增殖指数,GdCl_3能够增强缺氧的作用,但上述效应可以被LY294002抑制。结论:PI3K/AKT信号通路在缺氧活化CaSR并促进A549及A549/DDP细胞增殖中起重要作用。     

T-cadherin在脂联素抑制缺氧/复氧导致的乳鼠心肌细胞凋亡中的作用*

 目的： 通过腺病毒介导的RNA干扰技术沉默一种新的脂联素（APN）受体T-cadherin的表达,并建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型, 观察T-cadherin对H/R所致心肌细胞凋亡的影响。方法： 选用原代培养72 h的心肌细胞进行实验,随机分为5组:（1）空白对照组:心肌细胞正常培养;（2）H/R组;（3）APN+H/R组;（4）Ad-T-cadherin-siRNA+APN+H/R组;（5）Ad-HK（腺病毒阴性对照)+APN+H/R组。首先,确定最适合的腺病毒感染滴度,RT-PCR和Western blotting检测腺病毒介导的干扰RNA对T-cadherin表达的影响效果;其次,通过流式细胞术和TUNEL检测心肌细胞的凋亡。结果： 原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞。腺病毒感染的最佳MOI值为100,48 h后腺病毒的感染效率和红色荧光蛋白表达最强,其效率高于90%。RT-PCR和Western blotting证实腺病毒介导的siRNA转染的心肌细胞T-cadherin mRNA和蛋白水平均明显下降(P<0.05)。Ad-T-cadherin-siRNA+APN+H/R组心肌细胞凋亡率与APN+H/R组相比显著升高(P<0.05),与H/R组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论： 重组腺病毒Ad-T-cadherin-siRNA能够在体外高效感染原代心肌细胞,并成功降低T-cadherin在心肌细胞的表达;低表达的T-cadherin阻断了脂联素对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用。     

缺氧后适应中HSP90对补体介导的H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

目的:探讨缺氧后适应(HPC)中热休克蛋白90(HSP90)对补体介导的大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用及机制。方法:大鼠H9c2心肌细胞按处理方式不同分为7组:(1)对照组(常氧培养10 h);(2)H/R组(缺氧4 h后复氧6 h);(3)HPC组(缺氧4 h后行复氧5 min/缺氧5 min,重复3次,再复氧6 h);(4)HPC+格尔德霉素(GA)组(缺氧前20 min加入1μmol/L的HSP90特异性抑制剂GA后行HPC);(5)阴性对照组(转染空载质粒后行HPC);(6)C3过表达组(转染C3a质粒后行HPC);(7)C5过表达组(转染C5a质粒后行HPC)。采用Hoechst 33242染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测HSP90、C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:HPC在上调HSP90的同时显著减少H/R诱导的心肌细胞凋亡,并抑制C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和Bax的表达,增加Bcl-2的表达,上述效...     

附子多糖保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞及其抗内质网应激的机制研究

目的: 观察附子多糖对缺氧/复氧后心肌细胞的保护,并探讨附子多糖的保护机制是否与其抑制内质网应激反应有关。方法: 建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,将乳鼠心肌细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组(缺氧3 h后复氧6 h)和不同浓度附子多糖(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)+缺氧/复氧组。MTT法测定心肌细胞存活率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blotting分析葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表达,荧光定量PCR进一步检测CHOP及caspase-12 mRNA表达。结果: 缺氧复氧后,心肌细胞中内质网应激反应标志蛋白GRP78表达增加,内质网应激凋亡相关蛋白CHOP及caspase-12蛋白和mRNA表达亦明显升高。与缺氧/复氧组相比较,附子多糖预处理24 h后可以有效抑制缺氧/复氧引起的GRP78、 CHOP和caspase-12的表达上调,增加心肌细胞的存活率,抑制心肌细胞凋亡的发生。附子多糖的保护效应呈剂量依赖形式,10 g/L剂量时达到峰值。结论: 附子多糖保护缺氧/复氧后心肌细胞的可能机制与其抑制内质网应激所介导的细胞凋亡途径相关。     

α_2-肾上腺素能受体激动剂B-TH933抑制LPS处理的心肌细胞释放TNF-α

目的:观察α2-肾上腺素能受体激动剂B-HT933对脂多糖(LPS)刺激的心肌细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响,并初步分析其作用机制。方法:分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞。利用免疫荧光染色观察心肌α2A-肾上腺素能受体的分布;B-HT933和/或LPS处理心肌细胞一定时间后,用ELISA方法检测细胞培养液中TNF-α的含量、实时荧光定量PCR测定心肌细胞TLR4和TNF-αmRNA的表达、Western blot分析心肌细胞中相关信号分子的磷酸化水平。结果:免疫荧光染色证实乳鼠心肌细胞中存在α2A-肾上腺素能受体。LPS以剂量和时间依赖的方式刺激心肌细胞产生TNF-α,0.1μmol/L的B-HT933处理能显著抑制LPS诱导的TNF-αmRNA的表达和TNF-α蛋白的产生。而且,BHT能抑制LPS诱导的心肌细胞IκBα的磷酸化。结论:乳鼠心肌细胞上存在α2A-肾上腺素能受体,其激动剂B-HT933可能通过抑制心肌细胞IκBα的磷酸化来减少LPS诱导的TNF-α产生。     

甘氨酸受体在大鼠心肌细胞的表达

目的：检测成年大鼠心肌组织和新生大鼠心 肌细胞是否有甘氨酸受体（GlyR）mRNA和蛋白的表达。方法：选用成年 雄性SD大鼠心肌组织和新生SD大鼠培养心肌细胞，提取总RNA和膜蛋白，用逆转录－巢式聚 合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）检测GlyRα1和β亚基的mRNA 和蛋白表达。结果：成年大鼠心肌组织和新生大鼠培养心肌细胞均有与 脊髓组织GlyRβ亚基极为相似的mRNA和蛋白的表达；对于GlyRα1亚基，仅在新生SD大鼠培 养心肌细胞发现有mRNA的表达。结论：本研究证实在成年大鼠心肌组织 和新生大鼠心肌细胞中有与脊髓组织相似的GlyR亚基的表达，提示大鼠心肌细胞的膜上有Gl yR的存在。     

Increased phosphorylation of neurogranin in the brain of hypoxic preconditioned mice

Neurogranin/RC3 (Ng/rodent cortex-enriched mRNA clone #3), a postsynaptic neuronal protein kinase C (PKC) substrate, binds calmodulin (CaM) at low Ca(2+) levels. Neurotransmitters triggering influx calcium induce neurogranin phosphorylation by PKC in physiological or pathophysiological conditions. Phosphorylated Ng reduces the affinity of Ng to bind CaM, which may affect the activities of calmodulin-dependent downstream enzymes, such as nitric oxide synthase (NOS), CaM-dependent protein kinase II (CaMKII) and adenylate cyclase (AC). These protein enzymes have been reported to play key roles in the development of ischemic/hypoxic preconditioning (I/HPC). We previously demonstrated that activation of cPKCbetaII and gamma isoforms may be involved in the early phase of cerebral hypoxic preconditioning. However, as a substrate of PKC, the role of Ng in the onset of cerebral hypoxic preconditioning is unknown. In this study, we examined the effects of repetitive hypoxic exposure on the status of Ng phosphorylation in the cortex and hippocampus of mice. Using Western blot analysis, we found that the levels of Ng phosphorylation in the cortex and hippocampus of the hypoxic group of mice increased significantly from that of the normoxic group (p<0.05). These results suggest that neurogranin protein may be involved in the development of cerebral hypoxic preconditioning.     

精胺抑制模拟缺血-再灌注心肌细胞Fas/FasL的表达

目的:观察外源性精胺对缺血-再灌注损伤诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法:原代培养的乳鼠心肌细胞缺氧、无血清孵育2h,再复氧和复血清培养24h以模拟心肌缺血-再灌注损伤,并于再灌注期给予10μmol/L的外源性精胺。利用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率;电镜观察细胞超微结构变化;应用RT-PCR、Western blotting方法和免疫荧光的方法观察Fas、FasL mRNA的转录和蛋白的表达。结果:模拟缺血-再灌注后心肌细胞凋亡率为27.4%±1.8%,明显高于对照组(5.7%±0.3%),细胞超微结构出现凋亡、坏死等改变,Fas、FasL的转录和蛋白表达均明显上调,与对照组比,Fas mRNA和FasL mRNA转录分别增加了2.2倍和2.4倍(P0.01);Fas和FasL的蛋白表达分别增加了1.7倍和1.9倍(P0.01);10μmol/L的外源性精胺干预后心肌细胞凋亡率降低为21.7%±1.3%,Fas、FasL的转录和蛋白表达也明显被抑制(与单纯模拟缺血-再灌注组比,P0.05或P0.01)。结论:外源性精胺可通过抑制Fas死亡受体途径而减轻模拟缺血-再灌注诱导的心肌细胞凋亡。     

胰岛素样生长因子I通过改善线粒体功能保护新生大鼠心肌细胞免于凋亡

 目的：探讨线粒体机制在胰岛素样生长因I(IGF-I)保护心肌细胞中的作用。方法：体外培养新生大鼠心肌细胞,过氧化氢处理诱导凋亡,JC-1线粒体膜电位检测法和透射电镜观察心肌细胞线粒体膜电位和形态的改变,Annexin V-FITC/PI双染色法、caspase-3活性测定、DNA-ladder分析和Hoechst 33258染色方法观察心肌细胞凋亡的情况。结果：过氧化氢可诱导心肌细胞凋亡,siRNA下调Kruppel 样因子9（KLF9）48 h后,心肌细胞线粒体膜电位下降率明显降低,由对照组的(24.0±1.6)%,降为IGF-I处理组的(18.3±1.2)%和KLF9下调组的(15.2±1.2)%;线粒体形态明显改善;DNA片段化改善;caspase-3活性降低,与对照组相比IGF-I处理组降低(1.30±0.28)倍,KLF9下调组降低(1.31±0.43)倍;Annexin V-FITC/PI双染法显示细胞凋亡率对照组为（42.5±1.8）%,IGF-I处理组为（22.4±4.2）%,KLF9下调组为（32.5±3.5）%;Hoechst 33258染色结果显示凋亡小体减少,KLF9下调组与IGF-I的抗心肌细胞凋亡效果相似。结论：IGF-I通过下调KLF9表达改善线粒体功能,保护心肌细胞免于凋亡。     

Downregulation of microRNA-100 protects H2O2-induced apoptosis in neonatal cardiomyocytes

Hypoxia or reoxygenation-induced cardiomyocyte apoptosis is one of the major causes of cardiac dysfunction. Recently, regulations of microRNAs were shown to play important roles in cardiomyocyte apoptosis. MicroRNA-100 (miR-100) is one of the cardiac miRNA that was up-regulated in failing heart. In this study, we identified that miR-100 expression was up-regulated in H₂O₂-induced apoptosis in neonatal mice cardiomyocytes in a time-dependent manner. Furthermore, functional analysis revealed that miR-100 downregulation attenuated H₂O₂-induced apoptosis. Through biochemical analysis of western blot, we found that miR-100 suppressed the expression of insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) during the process of hypoxia-induced apoptosis in cardiomyocytes. More importantly, ectopic down-regulation of IGF1R reversed the protective effect of miR-100 down-regulation on H₂O₂-induced apoptosis, revealing that miR-100 regulates cardiomyocyte apoptosis through the association of IGF1R. Taken together, our data demonstrated the functional role miR-100 in H₂O₂-induced apoptosis in cardiac dysfunctions.     

线粒体KATP通道开放对培养成年大鼠心肌细胞PKC epsilon转位激活的影响

目的：探讨MitoKATP通道特异性开放剂二氮嗪(DZ)预处理对PKCε的转位激活作用及其与活性氧生成的关系。 方法： 采用免疫荧光和Western blotting等技术检测培养成年大鼠心室肌细胞PKCε的表达。 结果： ①MitoKATP通道特异性开放剂DZ预处理能引起PKCε向心肌细胞肌丝样结构转位；②活性氧清除剂2-巯基丙酰氨基乙酸(MPG)能抑制DZ预处理引起的PKCε转位；③PKC特性抑制剂氯化白屈菜赤碱(CH)能完全消除DZ预处理引起的PKCε转位。 结论： MitoKATP通道开放能够激活PKCε向肌丝样结构转位。MitoKATP通道开放过程中生成的ROS是引起PKCε转位激活的重要原因。     

同型半胱氨酸对培养大鼠心肌细胞牛磺酸摄取及其影响机制的研究

目的：观察同型半胱氨酸（ＨＣＹ） 对培养大鼠心肌细胞牛磺酸摄取的影响及其影响机制。方法：应用［３ Ｈ］－ 牛磺酸同位素检测技术,测定ＨＣＹ 不同浓度或在ＨＣＹ 作用下牛磺酸作用不同时间对牛磺酸摄取量的影响,以及应用蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ） 抑制剂Ｈ７ 和多粘菌素（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ, ＰＢ） 观察大鼠心肌细胞在ＨＣＹ 作用下对牛磺酸摄取量的影响。结果：ＨＣＹ 呈浓度依赖性刺激大鼠心肌细胞对牛磺酸的摄取,１０ ～１００ μｍｏｌ／Ｌ 浓度组分别较阴性对照组牛磺酸摄取量增加３３ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） ～６７ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） ;ＨＣＹ 刺激心肌细胞摄取牛磺酸量呈时间依赖性,牛磺酸作用时间２ 、５ 和１０ ｍｉｎ时分别较作用１ ｍｉｎ 时增加４８ ％ 、２４５ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） 和３０６ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） ;ＨＣＹ 刺激摄取牛磺酸量分别为Ｈ７ 和ＰＢ 作用减少３５ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） 和４３ ％ （ Ｐ＜ ０－０１） 。结论：ＨＣＹ 促进大鼠心肌细胞摄取牛磺酸的作用可能与ＰＫＣ 所介导的蛋白磷酸化过程有关     

硫氧还蛋白硝基化在多柔比星诱导的乳鼠心肌细胞凋亡中的作用

 目的：探讨硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)硝基化在多柔比星诱导的乳鼠心肌细胞凋亡过程中的作用。方法：体外分离培养新生SD大鼠心肌细胞,直接给予多柔比星刺激和预孵育过氧亚硝基阴离子(ONOO-)清除剂锰(III)四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉(MnTMPyP)后再给予多柔比星刺激。MTT检测细胞存活率,细胞凋亡荧光Hoechst 33258试剂盒检测细胞凋亡情况,分光光度法检测caspase-3的活性,Western blotting法检测聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶1剪切片段［cleaved poly(ADP-ribose) polymerase-1,cleaved PARP-1］、凋亡信号调节激酶1 (apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)、磷酸化ASK1（p-ASK1）、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）和磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）的表达,免疫沉淀法检测Trx-NT和Trx-硝基酪氨酸的形成。结果：给予多柔比星后,心肌细胞Hoechst荧光染色观察到明显凋亡,MnTMPyP预保护后,凋亡情况减轻。多柔比星组与正常组相比,Trx硝基化水平升高,caspase-3活性、cleaved PARP-1和p-p38 MAPK表达增加(P<005),Trx-ASK1和p-ASK1表达减少(P<005)。MnTMPyP预保护组与多柔比星组相比,Trx硝基化水平降低(P<005),caspase-3活性、cleaved PARP-1和p-p38 MAPK表达降低(P<005),Trx-ASK1和p-ASK1表达增加(P<005)。结论: 多柔比星刺激心肌细胞后,Trx硝基化水平和细胞凋亡明显增加;给予ONOO-清除剂MnTMPyP后,Trx硝基化程度和凋亡情况得到明显改善。Trx硝基化可能是多柔比星诱导心肌细胞凋亡的机制之一。