RNAi抑制星形胶质细胞Cx43对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术对星形胶质细胞Cx43蛋白的抑制作用以及对细胞缺氧/再复氧后凋亡的影响。方法化学合成针对大鼠Cx43基因的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)及其阴性RNA,通过脂质体转染体外培养原代星形胶质细胞,Western blot检测Cx43蛋白表达情况,MTT法检测siRNA转染对细胞的毒性作用;通过流式细胞术观察抑制Cx43蛋白对星形胶质细胞缺氧/再复氧后细胞凋亡情况的影响。结果 Western blot结果可见,转染siRNA后12h,Cx43蛋白表达开始抑制,48h抑制最明显,MTT结果显示siRNA组和脂质体组的细胞活性明显低于未转染组(P0.05),siRNA组与脂质体组未见明显区别(P0.05);流式细胞术示缺氧12h复氧不同时间,凋亡率逐渐增加,复氧48h凋亡率最高,siRNA干扰组明显低于正常对照组(P0.05)。结论 RNAi技术是研究Cx43功能的一种有效方法,siRNA转染能有效抑制星形胶质细胞Cx43蛋白表达,siRNA转染时,细胞毒性来自脂质体;siRNA抑制Cx43蛋白能够明显减轻星形胶质细胞缺氧/再复氧后的细胞凋亡。     

RNAi对细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中表达的沉默作用

背景：利用RNAi技术引发细胞因子信号转导抑制因子1沉默可促进神经内分泌肿瘤细胞的凋亡,然而对于内皮细胞是否有类似的作用,目前尚不清楚。 目的：实验拟验证内皮细胞中是否有细胞因子信号转导抑制因子1表达,并在所设计的siRNA中,筛选出1对对细胞因子信号转导抑制因子1沉默效率最高的siRNA。 设计、时间及地点：随机对照,体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在南昌大学医学院第二附属医院所属的江西省分子医学重点实验室完成。 材料：人脐静脉内皮细胞由南京凯基生物公司提供。 方法：设计并化学合成4对靶向细胞因子信号转导抑制因子1的siRNA：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。培养人脐静脉内皮细胞,利用RT-PCR检测人脐静脉内皮细胞是否有细胞信号转导抑制因子1表达。将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25,50,75,100 nmol/L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率,对比得出有最佳转染效率的浓度。然后,实验根据不同的处理因素分成8组：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组4个对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48 h后提取RNA。 主要观察指标：利用RT-PCR测定细胞因子信号转导抑制因子1 mRNA的相对表达水平。 结果：人脐静脉内皮细胞高表达细胞因子信号转导抑制因子1。siRNA在50 nmol/L时有较高的转染效率。4对siRNA干扰后,细胞因子信号转导抑制因子1 mRNA的表达水平与阴性对照、转染试剂组和空白对照组相比明显下调(P < 0.05),与阳性对照组相比显著下调(P < 0.01),其中siRNA-3的沉默效率最高(P < 0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组与阳性对照组相比明显下调(P < 0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：内皮细胞中存在细胞因子信号转导抑制因子1表达。RNAi抑制细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中的表达,实验筛选出1对沉默效率最高的siRNA。     

筛选介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳试剂*★

背景：理想的细胞转染试剂应具有高效安全的特点。 目的：筛选能够高效介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳转染试剂。 方法：应用Lipofectamine RNAiMAX，Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导FAM-siRNA和多药耐药基因MDR1siRNA转染原代肝癌细胞，分别于转染6和48 h后应用流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测转染效率，然后用MTT法检测3种转染试剂处理原代肝癌细胞24 h后的细胞毒性。 结果与结论：对于Lipofectamine RNAiMAX，Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导的FAM-siRNA和MDR1 siRNA转染，流式细胞仪和实时荧光定量PCR仪检测出RNAiMAX转染效率最高(P < 0.05)，分别为70.3%和71.5%。MTT法检测结果表明RNAiMAX对原代肝癌细胞没有表现出细胞毒性。结果提示，由于RNAiMAX介导的FAM-siRNA和MDR1 siRNA转染的效率最高，并且对细胞的毒性最小，所以RNAiMAX是最适合介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的转染试剂。     

siRNA抑制神经元NgR mRNA的时效关系和毒性研究

目的了解化学合成小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对原代培养神经元Nogo受体（Nogo receptor，NgR）mRNA作用的时效关系和毒性作用。方法化学合成一段针对大鼠NgR基因编码区的siRNA，用阳离子脂质体转染大鼠皮层神经元。分别于转染前、转染后24h、48h、72h、96h行RT．PCR检测NgRmRNA水平。碘化丙啶（PI）染色检测转染后各时间点神经细胞的存活情况。结果转染siRNA后24h和48hNgR mRNA水平明显下降，到72h明显回升，转染后96hNgRmRNA水平与转染前差异无统计学意义。PI染色显示转染后24h和48h，用脂质体转染的细胞（包括转染siRNA、无关序列Oligo和单纯脂质体组）其PI阳性率与非转染对照组无统计学意义，而转染后72h和96h两者差异有统计学意义，但在各时间点，脂质体转染的各组间PI阳性率差异无统计学意义。结论化学合成siRNA能有效促进原代皮层神经元的NgRmRNA降解，并于短期内维持于低水平。该段siRNA转染的毒性作用主要来自于转染试剂，与序列本身无明确关系。     

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

阻断Eag-1通道活性抑制胶质瘤细胞增殖的研究

目的 探讨阻断Eag-1通道活性对胶质瘤细胞生物活性的影响. 方法 设计3对Eag-1通道蛋白的特异性小分子干扰RNA(siRNA)并转染入U87细胞,RT-PCR及Western blotting检测其对U87细胞Eag-1 mRNA和蛋白表达的影响;将50 nmol/L siRNA1、siRNA2转染U87细胞,同时设5、10、20、30和40mmol/L奎尼丁(Eag-1通道特异性阻断剂)组和空白对照组,MTT法观察作用24、48、72 h后U87细胞增殖情况,流式细胞仪检测作用48 h后细胞周期、细胞凋亡率、胞内活性氧簇(ROS)浓度的变化. 结果 RT-PCR及Western blotting结果 显示siRNA1和siRNA2转染U87细胞12 h后细胞Eag-1 mRNA、蛋白的表达产物带明显弱于空白对照组,而siRNA3转染组产物条带虽也弱于空白对照组,但条带仍清晰;MTT检测结果 显示与空白对照组比较,50hmol/LsiRNA1、siRNA2转染组和10、20、30、40 mmol/L奎尼丁组细胞培养24、48和72 h后吸光度值均降低,差异有统计学意义(P＜0.05),奎尼丁IC50为33.7mmol/L.流式细胞仪分析显示与空白对照组比较,50nmol/L siRNA1、siRNA2转染组和33.7mmol/L奎尼丁组G1期细胞百分比、细胞凋亡率和胞内ROS水平均增加,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 阻断Eag-1通道活性能明显抑制胶质瘤细胞增殖,使G1期细胞比例、胞内ROS水平明显升高并诱导其凋亡.     

siRNA靶向沉默组织蛋白酶D对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默胶质瘤细胞系U87中组织蛋白酶D(CD)对胶质瘤细胞生物学行为的影响. 方法 采用脂质体介导的CD siRNA、scramble siRNA、空白对照siRNA转染体外常规培养的胶质瘤细胞株U87,RT-PCR、Western blotting分别检测转染后U87细胞CD mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染CD siRNA、scramble siRNA 1～5 d后U87细胞的增殖;细胞侵袭实验检测转染CD siRNA、scramble siRNA 48 h后细胞侵袭能力的变化. 结果 转染48 h后CD siRNA组细胞CD mRNA、蛋白的表达明显低于转染scramble siRNA和空白对照siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);转染后2、3、4、5d转染CD siRNA组U87细胞吸光度(A)值低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞侵袭实验结果表明转染CDsiRNA组滤膜细胞数低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 CD可能是具有广泛应用前景的胶质瘤分子生物治疗的靶点.     

RNA干扰抑制DLL4基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响

背景：Delta-like 4 (DLL4) 是近年新发现的血管生长调控因子,研究表明抑制DLL4可导致过度无效的血管生成。 目的：研究RNA干扰抑制DLL4基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：随机分组,对比观察,于2007-07/2008-09在南昌大学医学院和江西省医学生物高技术重点实验室完成。 材料：人微血管内皮细胞由上海细胞生物和生物化学研究所提供。 方法：设计和化学合成靶向DLL4基因的siRNA序列,lepofectamineTM2000介导DLL4 siRNA转染人微血管内皮细胞。提取细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应扩增,琼脂糖电泳检测DLL4 mRNA。提取细胞总蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用四甲基偶氮唑盐法检测DLL4 siRNA对人微血管内皮细胞增殖的影响,实验分4组：①85 nmol/L DLL4 siRNA-duplex组。②85 nmol/L DLL4 siRNA -scrambled 阴性对照组。③lepofectamine 组。④未经处理组。 主要观察指标：RNA干扰后,人微血管内皮细胞DLL4 的转录和蛋白表达及人微血管内皮细胞的增殖。 结果：反转录-聚合酶链反应和Western blot实验结果显示,人微血管内皮细胞转录DLL4 和表达DLL4蛋白;85 nmol/L DLL4 siRNA 完全抑制人微血管内皮细胞DLL4转录和DLL4蛋白的表达。DLL4 siRNA抑制人微血管内皮细胞DLL4表达的有效浓度为85 nmol/L。四甲基偶氮唑盐实验结果显示,85 nmol/L DLL4 siRNA -duplex组的细胞增殖率为190.00%,未经处理组的细胞增殖率为110.00%。 结论：人微血管内皮细胞表达DLL4,DLL4 siRNA抑制人微血管内皮细胞表达DLL4并促进人微血管内皮细胞增殖,DLL4对人微血管内皮细胞增殖具有抑制作用。     

化学合成siRNA抑制原代皮层神经元NgR的表达

目的筛选能有效抑制神经元NgR表达的siRNA序列。方法根据siRNA靶序列设计原则,设计并化学合成针对大鼠NgR基因编码区的siRNA三对,并以一对无关序列的寡核苷酸作为阴性对照。原代培养的大鼠皮层神经元分为5组:siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、无关序列组、非转染组,用阳离子脂质体TransMessenger Transfection Reagent转染。转染后48h行RT-PCR和免疫细胞化学检测NgR表达水平的变化。结果转染48h后,与序列2、3和无关序列转染以及未转染的细胞相比,序列1转染的神经元NgR mRNA水平明显下降,并且其NgR抗体免疫荧光染色的荧光强度也明显减弱。结论化学合成siRNA能有效地抑制原代皮层神经元NgR的表达。