MASPIN真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响

目的 构建MASPIN真核表达载体,分析MASPIN过表达对胃腺癌细胞株SGC7901的影响.方法 PCR扩增MASPIN基因全长,用载体PCR2.1构建重组质粒,转染至胃癌细胞株SGC7901.RT-PCR、Western blot检测MASPIN基因表达变化,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪(FCM)分析细胞周期,观察过表达MASPIN对SGC7901细胞株的影响.结果 成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体并转染至胃癌细胞株SGC7901,转染上调了SGC7901细胞株MASPIN在mRNA、蛋白水平的表达.转染MASPIN的SGC7901细胞增殖率随时间而减慢,第24、48、72小时的细胞增殖率分别为93.07%、81.97%、66.5%,明显低于转染空载体组(95.98%、95.79%、95.59%,P<0.05).与转染空载体组相比,过表达MASPIN的SGC7901细胞株在G0/G1期所占比例明显提高(70.3% vs 55.6%),S期细胞减少(19.8% vs 34.9%,P<0.05).结论 成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体,过表达MASPIN 可抑制SGC7901细胞株的增殖.     

maspin/PCR2.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin/PCR2.1表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法:PCR扩增maspin基因全长,将表达载体PCR2.1用Hind111 XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到人肝癌高转移细胞株MHCC-97中进行表达,检测转染前后maspin表达的变化.结果:重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增;提纯、纯化后,用HindⅢ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到PCR2.1表达载体,并在人肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达.结论:成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,能在真核细胞中.     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

RNA干扰靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX-2基因和蛋白表达的研究

目的 利用RNAi技术,以胃癌SGC7901细胞COX-2作为靶点,建立有效的RNA干扰方法,为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法.方法 设计并合成6条COX-2 siRNA和1条阴性对照siRNA,用3种不同的转染试剂分别转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量PCR和Western blotting检测胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达.结果 TOPtranfection能够有效介导报告基因DNA(pcDNA/lacZ)转染SGC7901细胞,细胞转染率为56.0%,明显优于其它两种转染试剂,转染的pcDNA/lacZ-siRNA对报告基因产生显著抑制;TOPtranfection介导的COX-2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX-2 mRNA表达,与对照组相比抑制效率达90%以上,最高达98.3%,同时抑制胃癌SGC7901细胞COX-2蛋白表达71.5%.结论 TOPtranfec-tion能够有效介导COX-2siRNA转染SGC7901细胞;靶向COX-2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX-2基因和蛋白的表达,为胃癌的治疗以及抑制胃癌复发和转移提供基因治疗新的靶点和方法.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

重组PinX1真核表达载体的构建及其对胃癌MKN28细胞增殖的抑制作用

目的 探讨PinX1基因对胃癌MKN28细胞生长及周期的作用,初步探讨该基因用于胃癌治疗方面的可能性.方法 构建重组PinX1真核表达载体,酶切及测序鉴定无误后,应用脂质体转染法转染入胃癌MKN28细胞,建立稳定转染PinX1基因的MKN28细胞系;应用Western blot技术从蛋白水平检测转染前后目标蛋白PinX1的改变;MTT法检测转染前后细胞生长曲线的变化;流式细胞仪检测转染目的 基因后细胞生长周期的改变.结果 成功构建重组PinX1真核表达载体;建立了稳定转染入PinX1基因的胃癌MKN28细胞系;转染PinX1基因后,胃癌细胞细胞生长明显减缓(P＜0.05),增殖变慢(P＜0.05),细胞生长阻滞于G0/G1期.结论 PinX1基因可抑制胃癌MKN28细胞的生长和增殖.     

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6 基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞. MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用. 结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确. 转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达. MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

内质网蛋白29过表达慢病毒载体的构建及其对胃癌细胞生物学行为的影响

目的：构建内质网蛋白29（ERp29）慢病毒过表达载体,探讨ERp29过表达对胃癌MGC803和SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法：构建带有红色荧光蛋白标签的ERp29基因表达质粒的慢病毒（pCDH-ERp29）和对照质粒（pCDH-Vector）,分别感染MGC803和SGC7901细胞;荧光显微镜观察细胞感染情况;CCK-8和平板克隆实验检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的增殖能力;Transwell小室实验分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭能力;应用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞中ERp29 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定显示成功构建pCDH-ERp29过表达载体,荧光显微镜下观察到成功感染胃癌细胞。CCK-8实验和平板克隆实验检测,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞增殖能力无明显变化（P>0.05）;Transwell小室实验,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭细胞数明显减少（P<0.05）。pCDH-ERp29组细胞中ERp29 mRNA和蛋白表达水平明显高于pCDH-Vector组（P<0.05）。结论：成功构建过表达ERp29基因的慢病毒载体,过表达ERp29基因可明显抑制胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭。     

过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF，uPA表达的影响

目的:探讨过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF和uPA表达的影响及意义.方法:构建maspin/pEFIRES-N表达质粒,重组质粒转染后,采用RT-PCR及Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平检测肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA转染前后的表达.结果:成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,并稳定转染到肝癌细胞株MHCC-97中.比较maspin/pEFIRES-N组和pEFIRES-N组的肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA的表达,结果显示转染maspin基因后在肝癌细胞株MHCC-97中maspin的mRNA和蛋白表达明显增强,而VEGF,uPA的mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.05).结论:在肝癌细胞株MHCC-97中,maspin基因的过表达会降低VEGF和uPA的mRNA及蛋白表达,从而可能抑制新生血管形成、阻断纤溶酶原激活物调节uPA的活性,减少ECM的降解,阻止肿瘤细胞的转移.     

2001年我国医药研究的若干进展

随着国内外生命科学和生物技术等的飞速发展,我国医药技术在2001年取得了长足的进步。提前完成了我国所承担的人类基因组汁划中的1％测序任务,到2000年,中国科学家在功能基因研究和基因组多样性领域共完成研究论文1850篇,遍及医药各领域,研究手段和水平可于国际先进水平媲美,中国完全有条件在“后基因时代”成为主角之一。     

小儿耳鼻喉手术麻醉的新进展

因小儿耳鼻喉手术刺激强,时间短,且常与气道相关,故麻醉的控制有一定难度,现对国内外现阶段小儿耳鼻喉手术麻醉的改良方法及新观点进行评述,以期对临床工作有较好的指导意义。     

成都市属医院1，175例儿童支气管肺炎住院费用分析

为探讨成都市不同级别医疗机构儿童支气管肺炎单病种费用水平以及不同收费项目占总费用的比例特点及控制医疗费用的有效途径,为患者自主选择就诊医疗机构提供参考指导,对成都市卫生局所属不同级别医院儿童支气管肺炎住院医疗费用分析如下。1资料与方法1.1资料来自成都市卫生局2     

Malaria in children in Birmingham in the 1970s

Thirty-two children with malaria were admitted to Dudley Road Hospital, Birmingham, in the 1970s. None was admitted before 1974 and there was a rapid increase after that. All the infections were due to Plasmodium vivax and occurred in children of Asian immigrant families who had been born in or had visited India or Pakistan apart from one infant born in England who acquired the disease transplacentally. All presented within 12 months of entering or re-entering the United Kingdom. The clinical features of the 32 patients have been analysed and it is suggested that more effort should be made to educate travellers about the need for anti-malarial chemoprophylaxis and the necessity to continue it for one month after return.     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。