8～10周龄胎儿心脏cDNA文库大规模表达序列标签分析

目的:研究心脏发育过程中基因表达特点.方法:随机选择8～10周龄胎儿心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库的克隆进行表达序列标签(EST)测序,结果与基因库/欧洲分子生物学实验室/日本脱氧核糖核酸数据库(GenBank/EMBL/DDBJ)进行同源性比较,所获EST进行功能分类,并比较其与10～12周龄胎儿及成人心脏表达基因功能分类的不同.结果:2 338条EST中,1 614条69.03%与已知基因匹配,547条(23.4%)与其它EST或基因组DNA相似,177条(7.57%)是新EST.发现了不同心脏发育时期中基因表达的特点.结论:大规模EST分析是系统研究心血管系统不同发育时期基因表达特点的有力工具.     

旋毛虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫保护性抗原及特异性诊断抗原基因，我们用异硫氰酸胍从旋毛虫肌肉或幼虫中分离总RNA，用PolyATtractmRNA分离系统统化mRNA，以NotIprimeradapter为引物合成双链cDNA，加SalIadapter,与λgt22A在体外进行连接包装并转染大肠杆菌Y1090r－，构建cDNA文库。结果获得5×105个重组噬菌体，重组率在90％以上．     

东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

目的 构建东方巴贝虫（Babesia orientalis）cDNA文库, 从中筛选免疫学阳性的克隆。 方法 用东方巴贝虫感染牛, 提纯红细胞内虫体的总RNA, 反转录合成cDNA, PCR扩增后将其连接于噬菌体载体（λTriplEx2）, 通过体外包装, 建成东方巴贝虫cDNA文库, 并进行扩增。用兔抗东方巴贝虫的血清筛选cDNA文库, 阳性克隆经大肠埃希菌BM25.8自身环化酶将噬菌体重组子λTriplEx2转化为相应的质粒重组子pTriplEx2, PCR鉴定插入片段大小, 并测序, 用Blast对测序结果进行同源性分析, 并对序列编码的氨基酸序列进行结构和功能的预测。 结果 未扩增文库的滴度为2.0×10⁶ pfu/ml, 重组率为98.8%, 文库插入片段大小为500~3 000 bp, 扩增后的滴度为5.8×10⁸ pfu/ml。从东方巴贝虫cDNA文库中筛选得到3个阳性克隆B04、B05和B41, 插入片段大小分别约为1 300、1 000和2 400 bp, 3个片段均包含开放阅读框, 分别与多种原虫的核动蛋白、功能未知的假定蛋白和热激蛋白70具有较高的同源性。B04、B05和B41分别编码310、192和647个氨基酸, 相对分子质量(Mr)分别约为34 000、21 000和70 700。 结论 构建了较高质量的东方巴贝虫cDNA文库, 并发现3个东方巴贝虫阳性克隆。     

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）登录GenBank；对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序，获得149个EST，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA，大部分为管家基因，其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。     

粉尘螨cDNA文库的构建

目的构建粉尘螨cDNA表达文库。方法提取粉尘螨总RNA和mRNA,以NotIdT18作为引物反转录合成第一链,置换法合成第二链。加EcoRI接头,经NotI酶切后,应用定向克隆技术将相应dscDNA片段插入λExCell/NotI/EcoRI/CIP载体的NotI和EcoRI双酶切位点间,经包装、转染宿主菌,构建成cDNA文库。检测文库库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入片段大小进行分析。结果已成功构建一个含4.8×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.2kb。结论所建文库容量及插入片段大小适合对粉尘螨特异性重组变应原的进一步研究。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

弓形虫cDNA文库的构建

目的：建立弓形虫ｃＤＮＡ文库。方法：用异硫氰酸胍酸性一步法提取弓形虫（ＲＨ株）ＲＮＡ，含ＰｏｌｙＵ的ｍＲＮＡ亲和膜分离Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ，进而合成双链ｃＤＮＡ。将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ接头连接，再与表达载体λｇｔ１１ＤＮＡ臂连接，经体外包装，感染大肠杆菌Ｙ１０９０。以３２ｐ标记的弓形虫ＲＨ株基因组ＤＮＡ为探针，对重组噬菌斑进行原位杂交。结果：ｃＤＮＡ产物分布在０．５－２ｋｂ，得到６．９７×１０５重组子，重组率为９８．７３％，克隆效率为６．９７×１０６克隆／μｇｃＤＮＡ。噬菌斑原位杂交的阳性斑点占重组克隆９５．２％。结论：用异硫氰酸胍酸性一步法提取弓形虫ＲＮＡ简便有效，已建立了一个容量大、质量好的弓形虫ｃＤＮＡ文库。     

成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆

目的 :构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸 (c DNA)文库 ,克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸 (c DNAs)。　　方法 :应用成人动脉和心脏组织 ,采用 Stratagene的建库试剂盒构建 c DNA文库。将随机克隆 5 '端表达序列标签序列与 Gen Bank/ EMBL/ DDBJ数据库进行同源性比较 ,新的全长 c DNAs采用步移法完成全序列测定获得。　　结果 :所建动脉 c DNA文库包含 2 .4× 10 6个独立重组克隆 ,插入片段平均长度为 2 .0 kb;心脏 c DNA文库包含 1.0× 10 6个独立重组克隆 ,平均长度为 1.8kb。首批得到了 8条新的全长 c DNAs,已在 Gen Bank登记注册。　　结论 :构建符合要求的 c DNA文库是克隆新的全长 c DNAs的一条快速有效的途径。     

藏族外周血淋巴细胞表达序列标签分析

目的对藏族外周血淋巴细胞cDNA文库进行随机大规模表达序列标签（ESTs）测序并进行生物信息学分析,通过序列比对找到与低氧适应相关基因有关的单核苷酸多态性（SNPs）位点。方法将部分文库经大肠杆菌BM 25.8质粒化,用5′端测序引物进行测序,利用BLAST程序对获得的ESTs从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索和比对。结果经序列比对发现突变位点较多发生在UTR区域,同时一些基因的编码区域也发生蛋白序列的变化。对这些基因注释后发现,有些突变发生在与能量代谢、线粒体相关的基因及一氧化氮合酶上,如GTPase、NDUFA6、ATP5L、NOSIP。结论 ESTs技术是一个快速、有效寻找新基因的方法 ,是系统研究不同人群基因表达模式的有力工具。     

日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。     

棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建

目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株总RNA为模板,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA,采用长距PCR(long-Distance PCR,LD PCR)方法扩增得到双链cDNA,经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后通过色谱柱CHROMA SPON-400按分子质量进行分离,进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收纯化0.4~2.5kb分离产物。取1μl PCR产物与λ噬菌体连接,以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库,分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库,文库滴度为3.85×107pfu/ml,插入片段大小在0.4~2.5kb之间,重组率为100%(20/20)。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。     

节段分析法在胎儿先天性心脏病超声诊断中的临床应用

目的探讨节段分析法（segmentalanalysis）在胎儿先天性心脏病（CHD）超声诊断中的临床应用价值。方法回顾性分析2010年6月至2011年11月应用节段性分析法超声检查出的26例心脏畸形胎儿,其中简单型先天性心脏病（室间隔缺损、房间隔缺损）10例,复杂型先天性心脏病16例。结果26例心脏畸形胎儿中,出生后彩超证实5例（室间隔缺损4例、房间隔缺损1例）,误诊1例（产前诊断为膜周型室间隔缺损,产后彩超证实为右冠状动脉右室瘘）,其余心脏畸形胎儿经随访及省级医院超声复查证实后作引产处理。结论节段分析法在胎儿心脏超声检查中能系统地分析心脏结构异常,对于提高简单型先天性心脏病诊断准确度价值不大,对于复杂型先天性心脏病能提供更准确、更完善的诊断结果,对于妊娠筛选及产后干预有重要临床指导意义。     

胎儿心脏超声智能导航技术检查胎儿心脏先天性畸形的临床应用价值

目的 探讨胎儿心脏超声智能导航技术检查胎儿心脏先天性畸形的临床应用价值.方法 选择2018-07～2019-12于成都市第一人民医院经胎儿超声心动图检查诊断为胎儿心脏先天性畸形的单胎11例.于孕18.4～30.0(24.7±2.7)周应用胎儿心脏超声智能导航技术进行检查,分析先天性心脏畸形胎儿的心脏容积数据及9个胎儿心...     

嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及其抗原相关基因的表达

目的 构建嗜热吸水链霉菌cDNA文库并进行表达序列标签(EST)测序,从中筛选具有毒力作用的基因进行体外克隆并诱导表达.方法 利用RNA转录5’末端转换技术构建致农民肺嗜热吸水链霉菌的cDNA文库,将平板内克隆进行编号,取前1020个克隆提取质粒,进行EST测序.用生物信息学方法分析EST测序结果并预测基因功能,从中筛选出可能引起人体免疫反应的毒力因子.将这些目的基因亚克隆入pET-28a载体,将重组子转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导相应蛋白的表达.结果 成功构建了较高质量的嗜热吸水链霉菌cDNA文库,得到有义序列978个,获得单一基因347个,其中2段基因分别与胸膜肺炎放线菌外膜蛋白、转铁蛋白B的同源性为51％和42％,其开放阅读框长度分别为1554 bp和726 bp,分别编码517和241个氨基酸.将2段基因亚克隆入原核表达载体中,IPTG诱导表达产物的相对分子质量分别为63 000和30 000.结论 所构建的嗜热吸水链霉菌cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,文库中的EST数据将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选.