mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的 对mt1SU-巢式PCR方法 检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价.方法 采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)标本,采用 mtLSU-巢式PCR方法 对人源与鼠源肺抱子虫共有的基因进行扩增和序列...     

蓝氏贾第鞭毛虫C2株rRNA基因ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列测定与分析

内转录间隔区（internal transcribed spacer ITS）为真核生物rRNA基因（rDNA）中串联重复存在的大小亚基间的内转录间隔序列.研究表明,贾第虫rDNA包含18S、5.8S和23SrDNA,3者的内转录间隔区为ITS-1和ITS-2,前者位于18S和5.8SrDNA之间,后者位于5.8SrDNA和23SrDNA间.18S、5.8S和23SrDNA序列较保守,进化速率较慢,不同种生物间同源性较大;而ITS序列并不保守,进化速率较快,种间同源性较小,是鉴定生物种株的一个十分有效的分子标志.研究表明,不同宿主和不同地域来源的蓝氏贾第虫虫株存在遗传学差异.     

巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定

目的比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNA-ITS碱基序列的差异及其规律,同时为巴戟天及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记。方法对巴戟天及其常见混伪品的rDNA-ITS进行了PCR扩增、测序,并运用CLUSTALX、MEGA软件对该区进行序列分析。结果测定了巴戟天及其混伪品的rDNA-ITS区序列,包括ITS1、5.8S和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列。巴戟天与假巴戟天、羊角藤在ITS1和ITS2区的差异性分别为2.9%~5.8%和2.9%~4.2%,而与虎刺在ITS1和ITS2区的差异性则为21.2%和18.9%。根据ITS序列特征构建的系统树,混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类,然后与巴戟天聚在一起,而虎刺则单独聚为一支。结论rDNA-ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。     

巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性

目的探讨mtLSU-巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性以及应用于早期检测的可行性。方法大鼠随机分为7组（6组实验组,1组对照组）,每组10只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫：自第三周开始每周剖杀一组实验鼠,收集第三周至第八周实验组大鼠肺组织（LT）和支气管肺泡灌洗液（BAL）标本。同时采用镜检法和mtLSU-巢式PCR法对大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测。结果采用GMS染色镜检法于第五周开始检出肺孢子虫包囊,第六、七周包囊数最多。而采用mtLSU-巢式PCR法对实验感染大鼠LT和BAL进行检测。卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为第三周100％（10／10）、100％（10／10）;第四周100％（10／10）、80％（8／10）;第五周100％（10／10）、50％（5／10）;第六周90％（9／10）、100％（10／10）;第七周100％（10／10）、80％（8／10）;第八周100％（8／8）、87．5％（7／8）。结论mtLSU-巢式PCR法可在无症状的实验大鼠中检出卡氏肺孢子虫并且比镜检法早两周,其敏感性明显高于镜检法。     

冬虫夏草与其混伪品北虫草的ITS测序鉴别

目的:从分子水平鉴别冬虫夏草与其混淆品北虫草。方法:从冬虫夏草及其常见混淆品北虫草中提取DNA,以核基因组通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果:测得各样品rDNA的ITS及5.8S rDNA完全序列,18S和28S rDNA部分序列,分别为冬虫夏草459bp、北虫草548bp;二者ITS具显著差异,其中ITS1差异性达33.31%、ITS2差异性达26.67%。结论:ITS序列可有效地鉴别冬虫夏草及其混淆品北虫草。     

用半巢居PCR检测无创性标本诊断卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的 无创性诊断卡氏肺孢子虫肺炎。方法 采用一对半引物半巢居DHFR-PCR检测实验大鼠无创性标本-支气管液、血液及活检标本-肺及肝脏组织中的卡氏肺孢子虫DNA。结果 从59只经病理学检查证实的卡氏肺孢子虫肺炎大鼠中采集到的上述四种标本,卡氏肺孢子虫DNA的半巢居DHFR-FCR检出率分别为72．7％(32／44)、37．3％(22／59)、94．9％(56／59)和36．4％(8／22),而DHFR-PCR的检出率则仅为25％、13．6％、71．2％和9．1％。12只低感染度(0-1级)PEP大鼠的无刨性标本中卡氏肺孢子虫DNA的检出率由0提高至41．7％。正常鼠标本及各种病原体对照的半巢居DHFR-PER均为阴性。结论 用半巢居DHFR-PCR无创性地诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎具有敏感、特异、省时、省力等优点;本研究在血和肝脏中检出卡氏肺孢子虫DNA,揭示在卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型中存在虫血症和肺外卡氏肺孢子虫感染。     

不同产地何首乌的ITS序列研究

目的研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性,分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及5.8S rDNA完全序列,18S和26S rDNA部分序列,共约648bp,其中ITS1长度为195bp,5.8S长度为164bp,ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别,对野生资源品种的鉴定具有较好的分辨性。     

云贵两省三地牛带绦虫核糖体rDNA-ITS1序列分析

目的: 采用PCR克隆测序方法,对采自贵州省都匀、从江及云南省大理三地牛带绦虫,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种标本进行比较,为贵州都匀、从江及云南大理牛带绦虫标本鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种分类学地位.方法: 取贵州都匀株、贵州从江株、云南大理株和台湾桃园株成虫节片,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1区段,克隆测序;结合GenBank中已知猪带绦虫rDNA-ITS1序列,构建系统发育树.结果: 贵州都匀、云南大理牛带绦虫标本、台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的ITS1序列基本一致,同源性达98%～99%;贵州从江牛带绦虫标本ITS1序列与前三者有30个碱基差异,与台湾桃园、贵州都匀和云南大理同源性均为97%.系统发育树显示:贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本与台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的遗传距离最接近,距贵州从江牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.结论: (1)贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本属于牛带绦虫亚洲亚种,贵州从江牛带绦虫标本属于传统牛带绦虫.(2)rDNA-ITS1序列分析可以用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学研究.     

菟丝子rDNA ITS序列的测定及分析

目的研究菟丝子rDNA-ITS序列特征。方法分别采用PCR产物直接测序法和克隆测序法,对菟丝子属7个种rDNA的ITS区(包括ITS-1,5.8S rDNA和ITS-2)进行序列测定。结果菟丝子属植物ITS序列总长度约为612 bp,GC含量分别为:ITS-1区53%~63%,5.8S rDNA 48%~55%,ITS-2区46%~56%;苜蓿菟丝子种内的3个地理种发现了3个变异位点。用NJ法构建系统发育树显示:含日本菟丝子Cuscuta.japonica的分支处于系统树靠近基部位置,与之亲缘关系较近的依次为中国菟丝子C.chinensis和杯花菟丝子C.cupulata;余下5个种的分支中田野菟丝子C.campestris和五角菟丝子C.pentagona合为一支,南方菟丝子C.australis和苜蓿菟丝子C.approximata合为一支。结论NJ法建立的发育树与形态学分类基本相符,为菟丝子属植物分类鉴定提供了重要的分子依据。     

不同种质来源孩儿参的rDNA ITS区序列分析及鉴别

目的 通过分析不同种质来源孩儿参ITS序列,为孩儿参种内鉴别提供DNA分子标记。方法 利用特异性引物进行PCR扩增、克隆和测序,对孩儿参的rDNA ITS区间碱基序列进行测定,比较其差异。结果 参试的9个不同种质来源孩儿参的整个ITS长度变异为623～624 bp;其中ITS1为224 bp,G＋C量为52.91%～54.26%;5.8 SrDNA为155 bp,G＋C量为54.49%～55.13%;ITS2为244～245 bp,G＋C量为55.55%～56.41%。整个ITS区共有17个变异位点（2.72%）,ITS1、ITS2和5.8S的变异位点分别为7、7和3个,不同种质来源孩儿参均有若干个特异性的单核苷酸变异位点;各样品的序列同源性均在99.9%以上;序列间的遗传距离为0.003～0.013。显示了不同产地、不同种质孩儿参的变异是不超过1个种的范围内的变异。结论 可利用ITS区序列差异,鉴别不同种质来源的孩儿参。     

A clinical comparative study of polymerase chain reaction assay for diagnosis of pneumocystis pneumonia in non-AIDS patients

Background  Pneumocystis jirovecii pneumonia (PCP) is one of the most common and fatal infections in non-AIDS immunocompromised patients, which is difficult to diagnose by traditional morphologic methods. This study evaluated polymerase chain reaction (PCR) assays of Pneumocystis jirovecii mitochondrial large subunits ribosomal RNA in sputum and bronchioalveolar lavage fluid (BALF) for diagnosing PCP.

Methods  Sputum and BALF specimens from two groups were collected: one group (PCP group) included 20 patients definitely diagnosed of PCP by Gomori methenamine silver (GMS) stains of BALF; the other group (non-PCP group) included 40 patients. Each specimen was examined by GMS stains and PCR assays.

Results  GMS stains of BALF in PCP group were 100% positive (20/20), GMS stains of sputum in PCP group were 35% positive (7/20); GMS stains of BALF in non-PCP group were 100% negative (40/40), GMS stains of sputum in non-PCP group were 100% negative (40/40). PCR assays of BALF in PCP group were 100% positive (20/20), PCR assays of sputum in PCP group were 100% positive (20/20); PCR assays of BALF in non-PCP group were 100% negative (40/40), PCR assays of sputum in non-PCP group were 100% negative (40/40). Sensitivity and specificity of PCR assays of sputum and BALF were both 100%; positive and negative predictive values were also both 100%.

Conclusion  The diagnostic value of PCR assays of Pneumocystis jirovecii mitochondrial large subunits ribosomal RNA on sputum and BALF for pneumocystis pneumonia are both high and equivalent.

     

太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究

目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区（包括ITS1、5．8S、ITS2）碱基序列进行了序列测定。结果太子参脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITS1的起始端与ITS2的终止端，其中江苏溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。     

犬复孔绦虫ITS及5.8S rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析

目的以从我国广东广州和湛江犬小肠中采集的2条犬复孔绦虫作为研究对象。以保守引物NC5及NC2扩增犬复孔绦虫的ITS-1，5．8S及ITS-2rDNA片段并进行序列分析。方法将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体，重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后，对阳性菌落进行序列测定。结果来自广州和湛江的2条犬复孔绦虫ITS及5．8 S rDNA序列总长分别为1536bp、1385bp，2条犬复孔绦虫的ITS-1、ITS-2序列相差较大，分别为20．80％、27．17％，而5．8S序列相差较小（1．49％）。结论由于犬复孔绦虫ITS序列复杂，种内存在的差异大，故不适于作为犬复孔绦虫种的遗传标记。     

蛲虫核糖体DNA ITS1的PCR扩增及序列分析

目的 扩增人蛲虫（Enterobius vermicularis）核糖体DNA的第一内转录间隔区（ITS1）。方法提取人蛲虫的基因组DNA，PCR扩增rDNA的ITS1及部分5．8S片段，对该片段进行PCR—SSCP分析并测序。结果扩增的片段大小为334bp，包含Enterobius vermicularis全部的ITS-1（303bp）及部分5．8S（31bp）序列，ITS1种内序列一致。结论首次报道人蛲虫的ITS1序列，将为以ITS1作为遗传标记用于蛲虫鉴别诊断、系统发育等研究奠定基础。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

套式PCR在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值

目的采用套式PCR（二次扩增）替代传统PCR（一次扩增）扩增痰中结核分枝杆菌embB基因。探讨其在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值。方法选取本院已确诊的活动性肺结核住院病人68例和非结核肺部感染病人16例，嘱其留取晨痰，分别进行套式PCR扩增和传统PCR扩增，再行产物分析。结果68例活动性肺结核病人传统PCR扩增embB基因阳性结果为29例，阳性率为42．6％。套式PCR扩增embB基因阳性结果为47例。阳性率为69．1％，两者比较差异有显著性（X^2=9．66，P〈0．05）；16例非结核病人传统PCR和套式PCR和检测结果均为阴性，两者特异度均为100％。结论检测结核分枝杆菌embB基因突变，套式PCR灵敏度高于传统PCR．两者特异度相同，套式PCR能快速、敏感、特异地扩增结核分枝杆菌embB基因片段。     

刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析

目的对刺革菌科桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌及鲍姆木层孔菌4种药用真菌rDNA ITS片段进行分析,探讨该片段在中外同类真菌的系统学及鉴别研究意义。方法对这4种药用真菌的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用Clustal X、Mega3.1等软件对ITS区序列进行分析。结果获得rDNA ITS1、ITS2和5.8SrDNA完整序列,桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌、鲍姆木层孔菌的ITS1序列长度范围为244~324bp,ITS2序列长度范围为229~274bp。以圆瘤孢多孔菌(DQ200923)为外类群,用分子进化遗传分析软件得到了包括这4种药用真菌及GenBank中3个与这4种中3种相应真菌的ITS序列的系统发育树。这一分析结果与来自形态学的鉴别结果相吻合。结论ITS序列可作为这4种药用真菌分子鉴定的依据。