N—ras和C—myc反义寡核苷酸与p53和p16基因联合抑制人肝 …

目的：研究反义癌基因与抑癌基因联合抑制肝癌细胞生长的效果。方法：利用基因重组方法构建携带ｐ１６基因、ｐ５３基因的融合表达载体（ｐｃＤＮＡ１６￣５３）,利用基因合成仪体外合成Ｎ－ｒａｓ、Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸、并将Ｎ－ｒａｓ,Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸与ｐｃＤＮＡ１６￣５３融合表达载体转染到人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１细胞中,观察肝癌细胞生长情况及软琼脂集落形成能力。结果：联合治疗组肝癌细胞增殖速度最慢     

nm23H1正反义表达载体的构建

目的;构建ｎｍ２３Ｈ１正反义表达载体ｐｃ３ＡＮ和ｐｃ３ＡＭ。方法：将ｎｍ２３Ｈ１基因正,反向插入质粒ｐｃＤＮＡ３和ｐＲＣ／ＣＭＶ,并转染肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１。结果：转染正义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加,转染反义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低。结论：构建的载体能在肝癌细胞内有效表达。     

P53,P16基因联合抑制人肝癌细胞生长的实验研究

目的;研究Ｐ５３、Ｐ１６基因联合抑制人肝癌细胞生长的效果。方法：利用基因重线的方法构建Ｐ５３、Ｐ１６的融合表达载体ＰｃＤＮＡ１６－５３,利用磷酸钙沉淀法半ＰｃＤＮＡ１６－５３融合表达载体转染到人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１细胞中,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印染、,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印染及Ｗｅｓｔｅｒｎ印地检测Ｐ５３、Ｐ１６基因在人肝癌细胞中的转移、转录及表达,应用ＭＴＴ法检测Ｐ５３、Ｐ１６基因在人肝癌细胞中的     

野生型P53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的；观察野生型Ｐ５３对胃癌细胞系的生长抑制作用，方法，以逆转录病毒为载体将野生型Ｐ５３基因导入胃癌细胞系ＭＫＮ２８和ＢＧＣ８２３，检测Ｐ５６３对肿瘤细胞的影响。结果：Ｐ５３在转染细胞中表达水平提高，外源性Ｐ５３的导入使肿瘤细胞增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）水平明显降低；Ｇ０／Ｇ１期细胞数增加，Ｓ期降低。转染Ｐ５３基因的ＭＫＮ２８细胞裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论野生型Ｐ５３基因在与调节ＤＮＡ复制及细胞     

抑癌基因p53与癌基因mdm2在肺腺癌细胞系GLC—82中的相互作用

探讨抑癌基因ｐ５３和癌基因ｍｄｍ２在肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２中的相互关系和作用。方法；采用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｔｉｎ介导的ＤＮＡ转染法。用含有野生型ｐ５３基因和ｍｄｍ２基因的ＰＤＯＲ－ｎｅｏ逆转录病毒载体分别或共转染ＧＬＣ－８２细胞。结果：转染野生型ｐ５３基因可阻止ＧＬＣ－８２细胞生长；抑制ＧＬＣ－８２细胞ＤＮＡ合成；软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤性减慢，而ｍｄｍ２转染可拮抗野生     

人IL—12双亚基共表达载体的构建及其表达

构建人ＩＬ－１２的高效表达载体。方法采用ｐＣＤＮＡ３．１从已克隆ｐ４０ｃＤＮＡ基因与国外提供的ｐ３５ｃＤＮＡ基因上获得相应的编码荐因，分别构建表达载体进行转染。此后，又利用ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２双亚基共表达的逆转录病毒载体转导人肝癌细胞株，并经Ｇ４１８筛选。结果有功能活性的ＩＬ－１２的产生需要ｐ３５和ｐ４０基因的等量共转染，为此，人ＩＬ－１２双亚基共表达载体在转肝癌细胞株并经选择后，上清液中     

人野生型p53基因与逆转录病毒载体的构建及转染

应用逆转录病毒为载体构建了含人野生型ｐ５３基因的重组质粒，并成功地转染ψｃｒｉｐ包装细胞。本实验应用ＰＬＸＳＮ为载体，１．８ｋｂ野生型ｐ５３基因作为插入片段，通过Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶进行连接。用〔α—￣（３２）Ｐ〕ｄＣＴＰ标记野生型ｐ５３基因片段（１．８ｋｂ）为探针进行原位杂交。筛选出重组体，将其命名为ＰＬＸＳＮ－５３，然后用该重组体对ψｃｒｉｐ包装细胞进行转染。收集转染后的细胞，准备下一步感染ｐ５３突变细胞株研究之用。该质粒的构建和细胞转染实验为进一步研究野生型ｐ５３基因的抑癌作用及其表达与调控原理奠定了基础。     

野生型p53基因的表达及其对子宫颈癌细胞株的生长抑制作用

构建了可在哺乳动物细胞中表达人ｐ５３蛋白的重组质粒ｐ５３─ｐＳＶ２ｎｅｏ，分别转染猴肾细胞株ＣＶ─１及人子宫颈癌细胞株ＳｉＨａ。用ＰＣＲ法检测出转染细胞中的ｐ５３ｃＤＮＡ；用免疫组化ＡＢＣ法检测出ｐ５３蛋白的表达定位于细胞核内，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测出转染细胞中存在ｐ５３蛋白。结果表明，外源性野生型ｐ５３基因的表达可以使ＳｉＨａ细胞的细胞克隆形成效减少５０％，使细胞生长速度降低，但对ＳｉＨａ细胞的软琼脂克隆形成效无明显影响。提示ｐ５３基因的肿瘤抑制作用与野生型ｐ５３蛋白的量有关，并且是细胞类型特异性的。     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，并能在选择培养基中生长     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。     

Inhibiting effect of murine double minute-2 oncogene on apoptosis induced by retroviral-mediated wild-type p53

OBJECTIVE To investigate the effects of wild-type p53 (wtp53) on inducing apoptosis by restoring wtp53 expression in pancreatic adenocarcinoma cell line (PC-2) which contains mutant p53, and the interaction between murine double minute-2 (MDM2) and wtp53 in pancreatic adenocarcinoma.

METHODS A recombinant retroviral vector expressing wild-type p53 was constructed and packaged by packaging cell line PA317 cells using calcium phosphate coprecipitation method. The supernatant of the packaged cells PA317 was used to transfect the pancreatic carcinoma cell line (PC-2), then a transformed cell line PC-2/swtp53 was established. The recombinant vector pCMV-MDM2 was transduced into PC-2/swtp53 cell line by lipofectin-mediated method, a double transfected cell line (PC-2/swtp53/pCMV-MDM2) was formed. To determine the integration and expression of exogenous wtp53 gene in the transfected cells, polymerase chain reaction (PCR), Western blot and immunoprecipitation analyses were performed. Apoptosis was analyzed by means of flow cytometry, in situ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) analysis and DNA agarose gel electrophoresis.

RESULTS Transduction with the retroviral vector resulted in integration and expression of wtp53 gene in host cells. The apoptotic cells in PC-2/swtp53 and PC-2/swtp53/pCMV-neo cell lines were 12.1%-12.9%, while the double transfected cell line, PC-2/swtp53/pCMV-MDM2, showed less (3.2%) apoptotic cells than its parent cell lines.

CONCLUSIONS Restoration of expression of wild-type p53 with a retroviral vector can increase programmed cell death of pancreatic adenocarcinoma cells (PC-2) containing mutant p53. The overexpression of MDM2 protein has a negative regulating role in wtp53-induced apoptosis in PC-2 cell.

     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

融合自杀基因FCU1真核表达载体的构建与表达

目的 构建含有融合自杀基因FCU1的真核细胞表达载体pEGFP-FCU1，并转染肝癌细胞SMMC7721，初步探讨Fcu1／5-氟胞嘧啶(5-FC)系统对体外培养细胞的生长抑制作用。方法 用SmaⅠ，XhoⅠ两种限制性内切酶分别切割质粒pEGFP-C1和pCIneoFCU1，所得载体片断和目的基因片断连接后转化，阳性重组子转染肝癌细胞SMMC7721，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，用G418筛选出阳性细胞克隆后，进行体外药物敏感实验。结果 酶切鉴定重组子阳性克隆率约为60％，转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光；转染的细胞在5-FC作用下其生长抑制率明显高于未转染细胞的生长抑制率，且旁观者效应显著。结论 自杀基因FCU1真核表达载体构建正确，转染细胞成功并获稳定表达，FCUl／5-FC系统对肝癌细胞SMCC7721具有实验性的基因治疗作用。     

Caveolin-1 RNA干扰慢病毒载体的构建及其对肝癌细胞株SMMC7721侵袭的影响

目的 构建人Caveolin-1 RNA干扰慢病毒载体,探讨慢病毒介导的Caveolin-1 RNA干扰对人肝癌细胞株SMMC7721侵袭能力的影响.方法 应用pGCSIL-GFP-Caveolin-1 RNA干扰慢病毒载体感染SMMC7721,检测其转导效率、mRNA和蛋白水平的敲除效率,并检测对SMMC7721侵袭能力的影响.结果 pGCSIL-GFP-Caveolin-1 RNA干扰慢病毒载体感染SMMC7721的转导效率为(96.0±1.2)%;Caveolin-1 mRNA水平的敲除率约90%;Western blot显示感染后Caveolin-1蛋白水平显著下降;感染后SMMC7721的侵袭能力显著下降.结论 慢病毒载体构建的Caveolin-1 RNA干扰能有效敲除SMMC7721中Caveolin-1的表达,显著降低SMMC7721侵袭能力.     

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人肝癌细胞株SMMC7721增殖及DAPK mRNA表达的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC7721细胞增殖以及对死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase,DAPK)基因mRNA表达水平的影响。方法:用不同浓度(0.5,5.0,50.0μmol/L)的5-Aza-CdR对SMMC7721细胞处理后,采用MTT法检测细胞的增殖情况;半定量RT-PCR法检测各组细胞DAPK mRNA的表达水平。结果:5-Aza-CdR对肝癌细胞株SMMC7721生长有明显抑制作用,并且存在剂量依赖性反应关系(F=242.40,P<0.01);半定量RT-PCR结果显示,MMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平很弱,采用不同浓度5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞72h后,SMMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平呈剂量依赖性逐渐升高(F=360.41,P<0.01)。结论:5-Aza-CdR可诱导MMC7721细胞DAPK mRNA表达,并抑制SMMC7721细胞增殖。     

人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞DNA MTase基因mRNA表达的影响

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721内源性DNA MTase基因mRNA的表达的影响。方法：将将建的包含正、反义DNA MTase基因片段的真核表达载体用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA表达变化。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实证用脂质体法成功将重组载体转染入细胞：RT－PCR法检测DNA MTase基因mRNA表达，显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中DNA MTase基因mRNA表达下调。结论：人DNA MTase基因反义基因转染是一种有效，可靠的抑制肝癌细胞系SMMC－7721DNA MTase基因表达的方法。它为更多了解DNA MTase在肝癌发生的作用提供了帮助。     

pAFP-P53-EGFP靶向诱导AFP阳性肝癌细胞凋亡

目的研究pAFP-P53-EGFP对AFP阳性肝癌细胞的靶向促凋亡作用。方法将SD大鼠AFP启动子、沉默子和远端增强子Ⅲ组合为1.2kb的AFP基因调控序列,导入pEGFP-N1质粒的启动子处,构建pAFP-EGFP同时引入P53基因片段,构建pAFP-P53-EGFP重组质粒。转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,流式细胞术分析各细胞凋亡情况。分别将质粒pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP转染HepG2细胞进行DNA ladder分析及电镜观察细胞超微结构。结果 pAFP-P53-EGFP重组质粒转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,各组细胞凋亡率分别为:HepG2组%gate=2.65±0.08;HeLa组%gate=0.42±0.025;SMMC7721组%gate=0.39±0.018。AFP阳性的HepG2细胞凋亡率明显高于SMMC7721、HeLa细胞(P<0.05)。且转染pAFP-P53-EGFP质粒的HepG2细胞出现明显的DNA ladder,细胞超微结构亦显示出现凋亡。结论 pAFP-P53-EGFP可以在AFP阳性细胞中相对专一表达,且pAFP-P53-EGFP可通过诱导细胞凋亡从而达到抑制肿瘤作用。     

辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用

目的：研究携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(shTRAIL)基因的辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL在人肝癌细胞株中的表达及其促凋亡作用。方法：体外通过脂质体转染SMMC7721细胞。转染细胞分别接受0(假照组)、2、5和10 Gy X线照射,ELISA法检测sTRAIL的表达;细胞分为正常SMMC7721组,分别接受0(假照组)、2和5 Gy X线照射的转染空质粒pshuttle-Egr1组及转染重组质粒pshutlle-Eyr1-shTRAIL组,采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;分别取SMMC772细胞、转染STRAIL细胞、转染空载体及照射组细胞,采用克隆形成实验检测细胞存活率。结果：不同剂量X射线照射SMMC7721-shTRAIL细胞上清中可溶性TRAIL表达量明显高于假照组（P< 0.001）;与假照组比较,照射转染后SMMC7721细胞的凋亡细胞百分数明显增加（P<0.05或P<0.001）,细胞存活率明显下降（P<0.05
或P<0.001）。结论：pshuttle-Egr1-shTRAIL