羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞增殖及硝普钠诱导凋亡的影响

[目的]研究不同浓度羧甲基壳聚糖对体外培养椎间盘髓核细胞增殖及硝普钠诱导细胞凋亡的保护作用.[方法]体外培养大鼠椎间盘髓核细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定;分别加入不同浓度羧甲基壳聚糖培养24h,通过CCK-8细胞计数法检测髓核细胞的增殖情况;采用不同浓度硝普钠诱导髓核细胞凋亡,通过流式细胞仪检测早期凋亡细胞比例,并通过Hoechst 33342荧光染色检测髓核细胞凋亡核的形态学变化.[结果]CCK-8检测结果表明10～500μg/ml羧甲基壳聚糖作用髓核细胞24 h对髓核细胞增殖无明显作用(P＞0.05);流式细胞检测结果表明1～3mmol/L的硝普钠可诱导髓核细胞发生早期凋亡,加入50～200μg/ml羧甲基壳聚糖后硝普钠诱导的髓核细胞凋亡有不同程度的降低(P＜0.05).Hoechst 33342染色结果表明羧甲基壳聚糖可降低硝普钠诱导髓核细胞凋亡.[结论]一定浓度的羧甲基壳聚糖对髓核细胞增殖无明显影响,羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导下髓核细胞凋亡有保护作用.     

兔腰椎间盘髓核细胞的培养及形态观察

目的：通过对兔腰椎间盘髓核细胞的培养,观察细胞内的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素。方法：取兔腰椎间盘髓核细胞,在加10％灭活胎牛血清的F12－DMEM液中培养,建立体外髓核细胞培养模型。通过光镜、电镜观察,同时进行细胞活力测定。结果：（1）原代细胞生物学性状最接近体内细胞,传代后细胞呈现衰老现象。（2） 活力测定提示随着培养时间的延长及传代,活力逐渐降低。（3）髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。结论：兔腰椎髓核细胞的体外培养成功为人腰椎髓核细胞的培养奠定了基础。     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

芹菜素在静水压下对人体腰椎间盘髓核蛋白多糖核心蛋白基因表达的影响

[目的]探讨中药提取物芹菜素在静水压下对体外培养的人体腰椎间盘髓核蛋白多糖核心蛋白基因表达的影响.[方法]32例后路腰椎间盘髓核摘除术的志愿患者中获取的32个新鲜椎间盘髓核样品,每1例髓核样品被切成1～2 mm3大小的碎块,与1 ml培养基DMEM一同装入2.5 ml的注射器中.培养基中分别加入芹菜素(Apigenin)、一氧化氮合成酶的竞争性抑制剂NG-Monomethyl-L-arginine(简称L-NMMA)及一氧化氮的供体Sodium Nitroprusside(简称SNAP),在静水压装置中培养2 h后,对每组中的髓核样品进行石蜡包埋、切片,通过原位杂交来研究芹菜素对椎间盘髓核蛋白多糖核心蛋白的基因转录水平的调节作用.[结果]芹菜素3 atm组和L-NMMA 3 atm组蛋白多糖核心蛋白原位杂交结果显示阳性髓核细胞数最多,平均光密度值(MOD)最大.[结论]对于退变的椎间盘的髓核组织,芹菜素能够促进蛋白多糖核心蛋白mRNA的基因转录水平.     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞表达增殖细胞核抗原(PCNA)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为4组,实验组给予l～100 nmol/L地塞米松进行培养,对照组给与等量磷酸盐缓冲液(PBS),培养5 d后收集细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内PCNA mRNA表达的影响;并提取蛋白用Western blot方法检测PCNA蛋白表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果表明,1～100 nmol/L地塞米松可增加兔髓核细胞内PCNA的表达,当地塞米松浓度为100 nmol/L时效果最显著,分别增加了0.42和1.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内PCNA的表达增高.     

青霉素及克林霉素在兔椎间盘中的渗透性研究

目的：观察青霉素和克林霉素渗透兔椎间盘的情况，分析其渗透性差异的原因。方法：雄性成年新西兰大白兔14只，随机分成两组，每组7只，分别经兔耳缘静脉注射青霉素（A组）和克林霉素（B组）。A组每只每次静脉注射青霉素钠4．8mg，每隔0．5h一次，共给药5次；B组每只每次静脉注射克林霉素磷酸酯9mg，每隔2h一次，共给药5次。A、B组分别于末次给药后0．5h、2h抽取血样，1ml／只，随后立即处死，取出L4/5髓核。将所有血样和髓核采用高效液相色谱法（HPLC）检测药物浓度，计算药物在髓核中的渗透率（髓核药物浓度／血药浓度&#215;100％）。结果：克林霉素渗透椎间盘髓核的渗透率为38．7％～49．0％，平均为（43．3&#177;3．9）％：青霉素的渗透率为0～1．2％．平均（0．7&#177;0．5）％，两者比较有显著性差异（P〈0．0001）。结论：克林霉素渗透椎间盘髓核的能力比青霉素强。     

羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞增殖、细胞周期及细胞外基质分泌的影响

目的 观察羧甲基壳聚糖(CMCS)对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞细胞周期进程、细胞周期蛋白表达及分泌细胞外基质的影响.方法 使用酶消化法提取大鼠椎间盘髓核细胞并进行体外培养,Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞.将髓核细胞分为:对照组、不同浓度CMCS处理组(100、200、500 mg/L),作用24 h后通过碘化丙锭(PI)染色流式细胞技术检测细胞周期进程.通过荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Western blot法检测不同浓度(100、200、500 mg/L) CMCS对髓核细胞内增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白(Cyclin)D表达的影响,并通过FQ-PCR法检测不同浓度(100、200、500 mg/L) CMCS对髓核细胞分泌细胞外基质Ⅱ型胶原的影响.结果 培养的细胞经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定显示其表达阳性,表明为髓核细胞;通过FQ-PCR及Western blot检测增殖相关蛋白PCNA可见通过100、200、500 mg/L CMCS作用后髓核细胞表达PCNA与对照组比较分别增加12.3％、18.2％、54.2％与25.1％、52.7％、66.9％ (P ＜0.05);经流式细胞仪检测发现经100、200、500 mg/L CMCS处理的髓核细胞处于S期细胞比例是对照组的1.58、2.34与2.61倍(P＜0.05);Cyclin D表达分别是对照组的1.26、2.15、2.64倍与1.53、1.69、1.83倍(P ＜0.05);FQ-PCR及Western blot检测结果表明100、200、500 mg/L CMCS分别促进髓核细胞分泌Ⅱ型胶原表达是对照组的1.67、2.24、2.79倍与1.48、1.65、1.77倍(P＜0.05).结论 CMCS对体外培养髓核细胞增殖相关蛋白PCNA表达具有促进作用,可促进细胞周期进程及细胞周期蛋白表达,对髓核细胞分泌细胞外基质具有促进作用.     

辛伐他汀对兔髓核细胞的影响

目的 观察辛伐他汀对兔髓核细胞Ⅱ型胶原(ColⅡ)及聚集蛋白聚糖(Agg)表达的影响.方法 取兔髓核细胞进行原代培养,传至第3代行ColⅡ免疫组织化学鉴定后随机分为5组,以不同浓度辛伐他汀处理:A组:空白对照组;B、C、D、E组分别为0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L辛伐他汀组.运用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ColⅡ、Agg含量的变化,并行细胞活力检测.结果 辛伐他汀浓度超过0.2 μmol/L时ColⅡ及Agg的表达增加,0.4 μmoL/L时达到高峰(P＜0.05),0.8 μmol/L时ColⅡ及Agg表达下降.0.8 μmol/L处理组影响细胞活力,0.1～0.4 μmol/L范围时细胞活性无明显影响(P＜0.05).结论 辛伐他汀可促进兔髓核细胞ColⅡ及Agg的表达,改善椎间盘退变进程;在＜0.4 μmol/L的较低浓度内对细胞活力无明显影响.     

CDMP-1逆转人退变椎间盘髓核细胞的实验研究

[目的]通过CDMP-1促进退变髓核细胞外基质合成来逆转椎间盘退变.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第3代髓核细胞,应用CDMP-l分组进行干预实验.A组为对照组,B组和C组为实验组,B组加人100ng/ml CDMP-1,C组加入200ng/rnl CDMP-1.采用光学相差显微镜及透射电镜对对照组和实验组细胞形态和超微结构进行对比观察:XTT-PMS法检测各组髓核细胞12d的生长曲线,研究三组细胞间的生长动力学差异;实时荧光定量PCR检测髓核细胞,7,14,21d Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.[结果]光学相差显微镜及透射电镜示:两剂量实验组形态学上没有明显差异,与对照组相比,CDMP-1实验组能较好的维持髓核细胞生物形态学特性,延长退变髓核细胞的衰老;三实验组12d的生长曲线一致,两剂量的CDMP-1没有增加退变髓核细胞的增殖;实时荧光定量PCR示100ng/ml CDMP-1组:Ⅱ型胶原mRNA表达总体均数及3个时间点均高于另外两组任一时间点(P<0.05);糖胺多糖mRNA表达总体均数及14、21d 2个时间点均高于另外两组相应时间点(P<0.05),且Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达量随刺激时间增加而增加.200 ng/ml CDMP-1组:提高了糖胺多糖mRNA表达水平的同时,却降低了Ⅱ型胶原mRNA水平.[结论]100ng/ml的CDMP-l可以延长体外培养人退变髓核细胞的衰老,维持细胞生物形态学特性,提高退变髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达水平,在一定程度逆转了椎间盘髓核细胞退变.     

高渗应激下ERK信号转导通路在兔髓核细胞凋亡中的作用

[目的]观察高渗透压对体外培养的兔髓核细胞凋亡的影响及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号转导通路在此过程中的作用.[方法]用不同的渗透压梯度以及ERK1/2特异性抑制剂PD 98 059(50 μmol/L)分不同作用时间处理髓核细胞;流式细胞仪检测髓核细胞在不同处理组的凋亡情况,蛋白质免疫印迹技术检测各组ERK1/2和p- ERK1/2蛋白的表达情况;免疫荧光标记技术检测p- ERK1/2蛋白在髓核细胞内的分布情况.[结果]高渗透压(600 mOsm)培养基中兔髓核细胞凋亡显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P=0.013),并呈时间依赖性;PD98059预处理组与相应时间段同渗透压组相比,细胞凋亡进一步显著地增加(P=0.035);400 mOsm组及其抑制组在各时间段细胞凋亡均不明显;600 mOsm高渗透压显著激活p- ERK1/2的表达,并且在3h组表达水平最高,与对照组比较差异显著(P--0.027),而PD98059几乎阻断p- ERK1/2的表达;免疫荧光标记检测到p- ERK1/2在600 mOsm高渗组的细胞胞浆和胞核中均有分布.[结论]高渗透压(600 mOsm)应激下兔髓核细胞凋亡显著增加,而且激活的ERK1/2信号转导通路具有抵抗髓核细胞凋亡的作用;并且髓核细胞能够适应轻度增加的渗透压(400mOsm)环境.     

Rheoencephalography and the study of the pulsation of the cervical vascular network in the diagnosis of goiter and neck and mediastinal tumors

The authors have applied rheography of the brain and sphygmography of the vessels of the neck and mediastinum for the diagnosis of compression of the neck vessels and organs in goiter and tumors of retrosternal and deep cervical localization. The methods allow to recognize stenosing of the vessels in early stages and facilitate the diagnosis of these conditions.     

Ocular immunopathological characteristics and the involvement of the platelet-aggregation factor and the anti-PAF at the level of the eye

This lecture tries to systematize the data about PAF (platelet activating factor) complex implications in the different ocular immune responses, and about the therapeutical results of PAF antagonists ?n experimental and clinical inflammatory conditions.     

Relation between the structure of the annulus fibrosus and the function and failure of the intervertebral disc

A simple model is presented that explains the observed function and failure of the intervertebral disc in compression, torsion, and bending; this model is based upon the observed arrangement of collagenous fibers in the annulus fibrosus. The fibers are considered to have the same mechanical properties as tendon; thus the stresses required to produce a given deformation and which irreversibly damage the fibers can be predicted. Predictions of the mechanical behavior of the disc are in good agreement with published results for compression and torsion; no comparable experiments have been performed for bending. It is further predicted that torsion and bending are likely to cause annular failure and protrusion. Failure is likely to occur posteriorly because of the effect of forward bending and because in the flattened and reentrant discs of the lumbar spine, torsional stress is concentrated at the points of maximum curvature. The structure of the disc tends to protect the collagenous fibers in forward bending and torsion. Compression is predicted to cause end-plate fracture rather than annular failure.