三种反义c-myc RNA稳定表达对血管平滑肌细胞生长、增殖的影响

目的 研究反义基因在细胞中持续、稳定表达对平滑肌细胞生长增殖的影响。方法 将分别载有c(myc第1、2和3外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3导入大鼠主动脉平滑肌细胞（SMC）,并于持续筛选后1个月进行稳定表达检测。结果 aM1和aM2能持续抑制靶细胞Myc蛋白表达（分别为对照表达量的59.7%和81.3%）、增殖细胞核抗原（PCNA）表达（分别为对照表达量的52.4%和51.9%）,抑制靶细胞的生长增殖活性并以aM2作用最强（抑制率达到30%）,同时,aM2还有一定的延长细胞周期和减少DNA合成的作用,而aM3作用相反。另外,与瞬时表达相比,外源基因在靶细胞中的作用并非一成不变,而基因转染操作对细胞的影响会随着细胞的代偿逐渐减少并在短期内消失。结论 对c(myc中不同区域进行反义封闭会产生不同的效应,对其转录活性区进行封闭可取得最强的细胞生长抑制。而靶细胞对对外源基因导入可能具有“纠正作用”。     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

人c-myc反义真核表达载体的构建及其对BT325细胞c-Myc蛋白表达的抑制作用

目的：构建人c-myc第三外显子及3’非翻译区反义真核表达载体,用脂质体介导法转染人胶质瘤BT325细胞,以期降低其c-Myc表达水平．方法：采用基因重组方法构建真核表达载体;用G418筛选抗性细胞克隆;用免疫细胞化学ABC法检测细胞蛋白质的表达;用MTT法测定顺铂作用下,未转染及转染组细胞的存活率．结果：c-myc反义真核表达载体在BT325细胞中稳定表达,转染细胞c-Myc表达水平显著降低;c-Myc表达减弱细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性．结论：抑制c-mycDNA第三外显子及其3’端非翻译区反义表达载体能够显著抑制。c-myc基因的表达;c-Myc在化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中有重要作用．     

细胞间粘附分子-1反义DNA体外对内皮细胞细胞间粘附分子-1表达的抑制作用

目的：研究细胞间粘附分子-1（ICAM-1）反义DNA对内皮细胞ICAM-1表达的抑制作用。方法：构建ICAM-1反义DNA载体,用脂质体转染内皮细胞,TNFα刺激后,流式细胞术检测转染细胞表面ICAM-1蛋白的表达。结果：酶切鉴定证明,1.4kb的ICAM-1DNA片段反向连接到pcDNA3表达载体;流式细胞术检测显示,正常细胞加TNFα刺激后,表面ICAM-1表达明显升高（P<0.01）,转染细胞加TNFα刺激后表面ICAM-1表达无明显升高(P>0.05),转染细胞表面ICAM-1表达低于正常细胞（P<0.05）。结论：ICAM-1反义DNA体外可抑制细胞ICAM-1表达。     

c-myc反义RNA对NIH/3T3、人胃癌细胞生长及生物大分子合成的影响

采用c-myc反义RNA表达质粒与pSV_2neo质粒经电击穿孔技术共转染了NIH/3T3细胞和人胃癌823细胞,经适当浓度G418筛选后,获得其相应的转染细胞株。实验表明,该转染细胞在一定浓度Cd~(2 )诱导c-myc反义RNA表达后,细胞形态有所改变,生长速度受到抑制,DNA、RNA及蛋白质生物合成均有不同程度的变化。     

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。     

反义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞增殖的影响

目的：研究反义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞增殖的影响。方法：PC12细胞用Lipofectamine2000介导分别转染6.25,12.5,25.0,50.0,100.0及200.0mg/L的CIC-3反义寡核苷酸,50mg/LCIC-3正义寡核苷酸,50mg/LClC-3随义寡核苷酸,以转染10mg/LLipofectamine2000和未转染细胞作对照。利用MTT以及[3H]-胸腺嘧啶掺入实验检测细胞存活率及DNA合成情况,流式细胞术检测细胞周期。结果：与未转染细胞组比较,反义ClC-3寡核苷酸可以降低PC12细胞存活率,并抑制[3H]-胸腺嘧啶掺入到DNA,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少（P均〈0.05）。而转染脂质体、正义及随义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞的细胞存活率、DNA合成及细胞周期均无影响（P〉0.05）。结论：反义ClC-3寡核苷酸通过使PC12细胞周期被阻滞在G0/G1期而抑制细胞的增殖。     

红细胞分化相关因子1对人红白血病细胞珠蛋白表达的影响

目的：探讨红细胞分化相关因子（EDRF）1基因在人红白血病（HEL）细胞中珠蛋白表达的影响。方法：构建EDRF1真核正义和反义表达载体,转染HEL细胞并筛选稳定表达细胞克隆。然后利用Northern blot和逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）的方法观察红系标志基因表达水平的改变,应用凝胶阻滞电泳（EMSA）的方法观察红系转录因子DNA结合活性的改变。结果：与对照组相比, EDRF1过表达的HEL细胞中α－珠蛋白合成明显增加,EDRF1反义表达载体转染的HEL细胞中的α-、γ－珠蛋白合成下调,而红细胞生成素（EPOR）表达水平没有明显改变。红细胞特异的转录因子GATA－1和NFE2mRNA的表达在转染前后没有明显改变。GATA－1转录因子的DNA结合活性在反义表达载体染的HEL细胞中受到明显的抑制,而红系核因子（NF－E）2的转录活性则没有明显的改变。结论;EDRF1下调珠蛋白的合成是通过抑制红系特异的转录因子GATA－1的DNA结合活性实现的。     

核苷酸切除修复基因XPD反义RNA表达载体的构建及功能研究

目的 构建核苷酸切除修复基因XPD反义RNA表达载体，初步探讨其对肺癌细胞DNA损伤修复能力及药物敏感性的影响。方法 通过RT-PCR技术获取XPD cDNA(2-667bp)片段并反向插入真核7表达载体反义载体pcDNA3．1，采用脂质体法将构建的载体质粒转染肺癌细胞株A549，经G418筛选，采用抗肿瘤药物阿霉素、顺铂对细胞进行染毒干预，干预结果采用SCGE和MTT综合判定。结果 转染细胞XPD mRNA表达受到抑制。单细胞凝胶电泳显示转染细胞DNA损伤修复能力降低。MTT法显示转染细胞药物敏感性增高。结论 XPD反义RNA能降低肺癌细胞DNA损伤修复能力，其为核苷酸切除修复功能的研究提供了一个新的方式。     

反义P~(53)基因和mdm_2基因对肺腺癌细胞恶性表型双重抑制作用的实验研究

目的研究反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞中突变型P53的双重抑制,并观察其抑制肺腺癌细胞生长和促进恶性表型逆转作用。方法利用能表达反义产P53和mdm2基因的逆转录病毒表达载体在脂质体介导下,将PDOR－mdm2基因转染含有PDOR－FP53的肺腺癌GLG-82细胞中。经G418筛选获得GLG-82细胞同时含有反义P53基因和mdm2基因的克隆,这种双重转染的GLC－82细胞命名为PDOR－FP53／mdm2,并与导入空载体PDOR－neo和GLC-82亲本细胞作比较。通过DNA、RNA杂交观察外源基因转染细胞中表达情况,细胞生长曲线测定和3H－TdR掺入、软琼脂培养集落形成试验、流式细胞仪测定观察其对肺腺癌GLC-82细胞恶性表型的抑制作用。结果DNA、RNA杂交证实反义P53和mdm2基因转染GLC－82细胞成功并获得表达。细胞生长曲线测定和3H-TdR掺入试验结果表明,转染PDOR-PP53／mdm2基因的GLC-82细胞较转染PDOR-neo的GLC-82细胞活力减弱、增殖能力下降、DNA合成受阻、软琼脂培养集落形成率低。细胞周期分析结果显示,转染PDOR－FP53／mdm2的细胞G1期峰增高和S期峰降低,提示DNA合成减慢,细胞增殖受到抑制。结论反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞恶性表型有双重抑制作用。     

动脉内膜损伤及三种反义c-myc RNA的作用

了解反义ｃ－ｍｙｃ基因导入对血管壁的影响。方法将分别载有ｃ－ｍｙｃ第１、２和３外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体ａＭ１、ａＭ２和ａＭ３导入球囊损伤的兔股动脉壁,并于术后２１天表达检测。     

C－myc反义寡聚脱氧核苷酸抑制人脑胶质瘤细胞系BT_（325）Myc蛋白合成和细胞增殖并诱导其分化的研究

目的：探讨在体外ｃ－ｍｙｃ反义核酸是否可通过阻断人脑胶质瘤细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达而抑制细胞增殖并诱导分化．方法：人工合成与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ起始码及其后四个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，用它处理培养的ＢＴ３２５细胞，观察它对细胞增殖的影响．同时用免疫细胞化学方法检测细胞中Ｍｙｃ蛋白的水平以及能反映胶质瘤细胞分化的Ｓ－１００和ＧＦＡＰ两种蛋白的水平，分析这些指标的变化．结果：发现４ｕｍｏｌ／Ｌ的ｃ－ｍｙｃ反义核酸明显抑制ＢＴ３２５细胞的增殖和Ｍｙｃ蛋白的合成，且后者发生在加入反义核酸后１ｈ，并持续２４ｈ以上，而细胞增殖受抑制要到第５日才明显．从第２日到第５日细胞中Ｓ－１００和ＧＦＡＰ染色明显加深，反映细胞有分化趋势．用同样长度的无关序列寡聚脱氧核苷酸作对照，则未见上述变化，表明ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用是序列特异性的．结论：ｃ－ｍｙｃ反义核酸可特异地抑制ＢＴ３２５细胞中Ｍｙｃ蛋白的合成和细胞增殖，并能诱导其分化．     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

目的体外研究C-MYC反义寡核苷酸(ASODN)对人宫颈癌HELA细胞凋亡的影响,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法免疫组化、流式细胞术、半定量RT-PCR法鉴定ASODN的有效性;GIEMSA染色、流式细胞术检测凋亡指数(AI)、DNA LADDER检测细胞凋亡。结果转染后,免疫组化结果显示C-MYC蛋白表达降低;半定量RT-PCR结果显示C-MYC MRNA表达较空白对照组及阴性对照组明显减弱(P<0.05)。GIEMSA染色可见凋亡小体;流式细胞术结果显示转染后凋亡指数为(10.29±0.66)%,转染ASODN(C-MYC)联合放射的凋亡指数为(16.83±0.57)%,均明显高于空白对照组(1.79±0.19)%(P<0.05);DNA LADDER呈现具有凋亡特征的梯带。结论本实验所设计的ASODN能有效地抑制C-MYC基因的表达;转染ASODN(C-MYC)能够显著增加HELA细胞凋亡,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。     

反义c-myc重组腺病毒载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察反义c-myc重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用. 方法:构建大鼠反义及正义c-myc细菌质粒,并将所得细菌质粒及腺病毒E1缺失质粒导入293细胞系,经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体. MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用,免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对c-Myc蛋白的表达. 结果:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达. 结论:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖.     

阻断TGF α—EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的 研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法 构建了反义ＥＧＦＲ 表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ。转染反应反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,＾１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳,流式细胞术,。原位     

腺病毒介导的反义c-myc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究

目的 构建介导反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞的细胞周期,增殖和凋亡的影响。方法 将ｃ－ｍｙｃ基因反向克隆于穿梭质粒载体ｐＡｄＣＭＶ中,通过脂质体与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,经同源重组产生编码反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒。体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２和ＳＰＣ－Ａ－１以及人胚肺二倍体细胞２ＢＳ后,细胞周期的改变,凋亡的发生和相关基因表达的变化;体内观察对肿瘤     

重组腺病毒介导的反义c-myc基因对HL-60细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察重组反义c-myc腺病毒(Ad-Asc-myc)对急性早幼粒白血病HL-60细胞周期及增殖的影响,探讨其作用的分子机制.方法:将Ad-Asc-myc与鱼精蛋白硫酸盐(Protamine sulfate)混合后转染HL-60细胞,MTF法观察细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞增殖周期,RT-PCR检测c-myc转录变化,免疫细胞化学检测c-myc及增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化.结果:Ad-Asc-myc转染HL-60细胞后,细胞生长受抑,细胞周期呈现G1期延长、S期缩短,增殖指数逐渐下降,出现大量凋亡细胞.c-myc基因转录及表达下降,PCNA表达降低.结论:Ad-Asc-myc可使HL-60细胞的生长减缓,增殖能力降低,凋亡细胞增加.其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关.     

IL-1β反义RNA表达载体的构建及对肝癌细胞中IL-1β水平的影响

目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体，观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增IL-1β1和IL—1β2，将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，构建Pafp IRES2-antilIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体，利用jetPEI转染H22肝癌细胞和YAC-1淋巴细胞，荧光显微镜下观察反义RNA载体的表达，RT—PCR方法分析H22细胞中IL-1β表达水平的变化。结果RT—PCR扩增到两条长度分别为264和284bp的片段，与IL-1β1和IL—1β2相符，将其反向与Pafp IRES2-EGFP连接，经菌落PCR和DNA序列分析证实，获得了PafpIRES2-antiIL-1β1和Pafp IRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体。上述载体转染H22细胞后，荧光显微镜下可见细胞表达出明亮绿色荧光，而YAC-1细胞则未见荧光。RT—PCR分析证实转染反义RNA后H22细胞中IL-1β表达水平明显下降，尤以IL-1β2反义RNA的阻断效果更为显著。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌细胞特异性反义RNA表达载体PafpIRES2-antiIL-1β1，PafpIRES2-antiIL—1β2，两载体能有效地阻断肝癌细胞中IL-1β的表达。