杜氏利什曼原虫假定蛋白PA5的原核表达与生物信息学分析

目的扩增杜氏利什曼原虫假定蛋白PA5基因,原核表达该假定蛋白并预测其结构与功能。方法以杜氏利什曼原虫前鞭毛体基因组DNA为模板,巢式PCR法扩增该基因,将其克隆入pQE30质粒构建pQE30-PA5重组质粒,经IPTG诱导表达目的蛋白。采用生物信息学方法对该蛋白进行同源性分析、信号肽及跨膜区预测、蛋白质结构与B细胞抗原肽位点分析。结果成功扩增出PA5基因,序列全长为765 bp,构建的pQE30-PA5重组质粒,经诱导后目的蛋白以包涵体形式表达。所获得的蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为27 065,等电点为5.71的亲水性不稳定蛋白,不含信号肽及跨膜区。二级结构以α-螺旋及不规则卷曲为主,共含5个B细胞抗原肽片段。结论成功表达了杜氏利什曼原虫PA5蛋白,该亲水蛋白具有体液免疫刺激潜能,具有利什曼病潜在免疫诊断价值。     

深圳市1例黑热病病例实验室检测与分子鉴定

目的 对深圳市1例输入性黑热病病例进行实验室检测和分子溯源分析以确定感染虫株。方法 收集2023年3月15日深圳市确诊1例黑热病病例的骨髓穿刺液和血液进行实验室检测。对患者骨髓穿刺液涂片姬姆萨染色后进行显微镜检查,对血液样品采用内脏利什曼原虫快速诊断试剂（rk39）进行血清抗体检查,并提取全血DNA,PCR扩增内转录间隔区Ⅰ(internal transcribed spacer-1, ITS-1)序列并测序比对,同时基于ITS-1序列构建系统进化树。结果 对患者骨髓涂片显微镜检查查见大量利什曼原虫无鞭毛体,确诊为黑热病,患者血液采用rk39快速诊断试剂检测结果呈阳性,PCR扩增出ITS-1基因产物序列与预期大小一致,经NCBI数据库中比对,与婴儿利什曼原虫ITS-1基因序列相似度为100%,确定感染虫株为婴儿利什曼原虫。对扩增的ITS-1序列进行系统发育树构建发现与婴儿利什曼原虫聚到一个分支,且与所选的参比序列中的KC347299距离较近。结论 深圳市1例黑热病病例是由婴儿利什曼原虫引起的,黑热病在我国仍时有发生,应加强非疫区医务人员诊断技术,积极配合使用新的诊断技术进行辅助诊断,同...     

用分子杂交技术分析不同种株利什曼原虫动基体DNA同源性

用~(32)P和生物素标记利什曼原虫动基体DNA(k-DNA),以Southern 杂交法分析了杜氏利什曼原虫四川人分离株(四川人株),四川犬分离株(四川犬株)及蜥蜴利什曼原虫k-DNA微环同源性。结果表明,形态上不能区别的利什曼原虫k-DNA 微环同源程度有种和株水平的差异。用电镜观察四川人株和四川犬株k-DNA 网,测得两者微环周长相同。     

人ⅡA型磷脂酶A2的cDNA顺序与婴儿利什曼原虫DNA相似性分析

目的：了解人ⅡA型磷脂酶A2cDNA顺序和婴儿利什曼原虫DNA相似性的情况和原因。方法：利用BLAST工具,以人ⅡA型磷脂酶cDNA顺序中的片段对核酸数据库进行搜寻和比对,将获得的一致性片段进行收集、整理并分析、汇总利什曼原虫DNA的相关信息。结果：发现人ⅡA型磷脂酶A2cDNA与婴儿利什曼原虫DNA之间具有9个完全一致序列（≥16bp）,这些序列集中分布于利什曼原虫36条染色体的29、30号染色体上。结论：人ⅡA型磷脂酶cDNA顺序与婴儿利什曼原虫DNA片段之间具有一致性,可能与基因由原虫向人的横向传递有关。     

利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫分子系统发育学

目的利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫基因多态性及其分子系统发育学。方法采用PCR法获得中国不同地区利什曼原虫SSU rDNA,通过Clustal X软件比对序列碱基,构建贝叶斯进化树。结果中国不同地区流行利什曼原虫分属于不同的支序,在中国除了有杜氏利什曼原虫外,还有热带利什曼原虫和一支在国际上还没有定种的未定种存在。结论在中国有未定种利什曼原虫存在。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin.结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质...     

抗杜氏利什曼原虫单克隆抗体识别抗原分子的检测

本文报道用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法,对杜氏利什曼原虫新疆株前鞭毛体中McAbs识别的抗原成分进行了检测。我们制备的抗杜氏利什曼原虫新疆株McAbs(A-9、A-11、C-11、E-12和H-10)共识别7条特异性抗原区带,抗原分子量分别为77000、74000、59000、54000、48000、43000和41000。     

抗杜氏利什曼原虫杂交瘤单克隆抗体——针对中国株No.3抗体的检定分析

作者成功地获得8株分泌抗杜氏利什曼原虫中国株的单克隆抗体的杂交瘤。对其中5D11杂交瘤作了进一步检定分析,用5D11上清液对利什曼原虫不同种、株、期5种抗原进行ELISA实验,显示具有期特异性与一定程度种特异性。该单克隆抗体属IgG1亚类。用聚丙烯酰胺盘状电泳分析5D11杂交瘤腹水有一特异的明显区带,经进一步实验证明此区带即IgG1。初步定出在小鼠腹水电泳谱中IgG1的位置。     

全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建

目的：克隆分析新疆地区细粒棘球蚴95（Eg95)抗原全长基因的结构特点，并构建Eg95 DNA疫苗。方法：根据细粒棘球蚴95抗原基因序列设计PCR引物，应用PCR方法从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95全长抗原目的基因。利用定克隆技术将全长Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上，构建DNA疫苗pcDNA3-Eg95，测序确定基因碱基序列。利用DNAman软件及GeneBank/Blast功能，对其进行基因全序列分析及同源性比较。结果：从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆均为正确连接全长Eg95抗原基因的重组质粒，可作为DNA疫苗作进一步的研究。新疆株全长Eg95抗原基因与GeneBank中已登录的新西兰株Eg95抗原基因序列一致。结论：成功克隆并构建了新疆株全长细粒棘球蚴95抗原基因DNA疫苗。     

中国黑热病利什曼虫种的初步探讨

对4株分离自甘肃、山东及陕西流行区黑热病患者及1株分离自北京郊区流行区的一只貉的利什曼原虫,应用同功酶电泳方法进行初步鉴定,分别属于杜氏利什曼原虫及婴儿利什曼原虫。     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达

[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

GST-Fank1融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

 摘要 目的： 研究转录因子Fank1与GST融合蛋白原核表达载体的构建和表达。方法： 根据编码Fank1蛋白的DNA序列,经引物设计软件Primer Premier 5.0优化设计出上下游引物（Ⅰ,Ⅱ）,同时在5′端引入BamHⅠ酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以pdsRED-Fank1质粒为模板进行PCR扩增Fank1目的片段,经限制性内切酶酶切后连接到原核表达载体pGEX4T-2, 构建成pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导进行目的蛋白表达。 结果： 经菌液PCR、电泳分析及测序证明成功构建了Fank1融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹显示,相对分子量为44KD的蛋白条带,与预期一致。 结论： 成功构建了pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,并在原核细胞中有表达,为进一步研究转录因子Fank1的功能奠定了基础。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

重组人B淋巴细胞刺激因子基因原核表达载体的构建及鉴定

目的构建人BLyS基因原核表达载体。方法采用RT-PCR方法,从人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到474bp的人BLySDNA片段,再用BamHI和EcoRI双酶切后,克隆到原核表达载体pGEX-5X-3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒。结果BLyScDNA已经正确克隆到原核表达载体pGEX-5X-3中。结论本实验为研制抗人BLyS单克隆抗体来研究人BLyS与自身免疫性疾病的关系奠定了基础。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原(mPSCA)基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

Prokaryotic expression of Chinese bovine enterokinase catalytic subunit

Background To express in vitro the bovine enterokinase catalytic subunit (EKL) protein, which could be used in the future for the cleavage and purification of fusion proteins.Methods Bovine enterokinase catalytic subunit cDNA was obtained by RT-PCR from the duodenal mucosa of a bovine obtained at a wholesale market, and then cloned into a pUCmT cloning vector and sequenced. The desired gene fragment was inserted into a pET39b expression plasmid and the recombinant vector pET39b-EKL was transformed into E. coli BL21 (DE3). Protein expression was induced using IPTG. The recombinant DsbA-EKL was purified with His·Tag affinity chromatography, and its bioactivity was analyzed.Results Compared with the sequence deposited in GenBank, the sequence of the EKL gene cloned in the present study is correct. It was also confirmed that the nucleotide sequence of expression plasmid pET39b-EKL was correct at the conjunction site between the recombinant DNA 5’terminal multi-cloning site and the recombinant fragment. SDS-PAGE analysis indicated that the target product was about 65 kDa and represented 28% of total cell protein. Purified recombinant protein was obtained by metal chelating chromatography using a Ni-IDA resin. After desalting and changing the buffer, the crude kinase was incubated at 21℃ overnight and shown to have a high autocatalytic cleavage activity.Conclusion The EKL gene from a Chinese bovine has been cloned successfully and expressed. This investigation has layed the foundation for future enterokinase activity research and for further large-scale application of expression products.     

人微小病毒B19 VP2蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：利用原核系统表达人微小病毒B19的重组蛋白抗原,为建立ELISA方法诊断B19病毒感染提供特异性抗原。方法：采用PCR方法扩增B19 VP2基因,将之插入到T载体中进行测序,验证序列正确后再重组入原核表达载体pET-30a( ),并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达。用SDS-PAGE分析表达产物。表达产物经亲合层析柱纯化得到VP2重组蛋白抗原。用B19 VP2 IgG对该蛋白进行了Western-Blot分析。结果：筛选出2株B19 VP2蛋白抗原高表达菌株,经IPTG诱导后,表达VP2重组蛋白量占菌体总蛋白量的24．6％。结论：VP2重组蛋白具有良好的抗原活性。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.