新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素Ⅲ基因研究

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体,将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入 ｐＫＡ质粒的 ＡＳＰｓⅡ编码基因 ａｎｓＢ中,使 ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的 ８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 ＨＶ３形成融合蛋白,从而构建成 ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒 ｐＫＡＨ,通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 ｐＵＣ高拷贝数复制原点,进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体 ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌 ＪＭ１０５宿主细胞中表达后,融合蛋白（１５． ６ ｋＤ）占细菌总蛋白 １０ ５％,该融合蛋白经 ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子,抗凝血活力达约 ２０ ＡＴＵ／ｍｌ培养液,为以后进一步研究打下了基础。     

弓形虫p30抗原基因体外扩增及其重组质粒构建

为构建弓形虫主要表面抗原ｐ３０基因重组质粒，根据已发表的弓形虫主要表面抗原ｐ３０基因序列，设计合成引物Ｐ１、Ｐ２。在两引物的５末端分别加上了ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－ｐ３０，转化大肠肝菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选、ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了鉴定证实构建了ｐ３０基因重组质粒。     

膀胱癌多药耐药基因与p53基因表达的临床意义

目的 探讨膀胱癌中多样耐药基因（ＭＤＲ１）与ｐ５３基因表达的临床意义。方法 采用免疫组化（ＳＡＢＣ）法对３５例膀胱移行细胞癌中ＭＤＲ１表达产物Ｐ－ＧＰ与ｐ５３基因产物ｐ５３蛋白进行了检测。结果 ３５例膀胱移行细胞癌中Ｐ－ＧＰ、ｐ５３阳性率分别为４０％和４８．６％,随膀胱癌的病理分析和临床分期而增高。Ｔ２～Ｔ４期同Ｔｉｓ～Ｔ１期相比,ＭＤＲ１及ｐ５３的表达均有显著性差异,ＭＤＲ１与ｐ５３的表达无相关     

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ酶切，获得人碱性成纤维细胞生长因子基因，将该基因插入原核高效表达载体ＰＢＶ２２０的ＰＬＰＲ启动子下游，获得重组质粒ＰＢＶ－ＦＧＦ，转化大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃诱导使重组子表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、ＭＴＴ活性检测结果表明，该重组菌能够表达具有生物活性的ｈｂＦＧＦ。     

人EPO cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人红细胞生成素（ＥＰＯ）的工程细胞株。方法：用 ＤＮＡ磷酸钙共转染法,将人ＥＰＯ ｃＤＮＡ的表达质粒 ｐＣＤＢ与标志质粒 ｐＳＶ－ｄｈｆｒ共转染到 ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。用 ＥＬＩＳＡ法检测到 ７０个克隆的细胞培养上清,筛选出５０个克隆细胞系。结果：经ＭＴＸ加压扩增,获得４系高效表达ＥＰＯ的细胞系（Ｂ４、Ｃ３、Ｆ１０、Ｇ７）,表达量为 ２． ２～１０ μｇ／（１０６ ｃｅｌｌ· ２４ ｈ）,ＥＰＯ的分泌量在上述细胞系扩增了 １１～３１倍。 Ｆ１０细胞系表达量为最高,并进一步亚克隆纯化。其中Ｆ１０－６亚克隆细胞株的平均表达水平为１０ ｕｇ／（１０６ｃｅｌｌ·２４ ｈ）,细胞冻存后复苏传代１５次,ＥＰＯ的表达水平无明显改变。结论：以Ｆ１０－６亚克隆细胞株建立了工程细胞株。     

6例河南株HGV NS5基因变异的研究

目的：探讨河南省庚型肝炎病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴＮｅｓｔＰＣＲ） 扩增ＨＧＶＮＳ５ 区序列;将ＰＣＲ扩增产物克隆入Ｔ载体,进行测序和分析。结果：河南株ＨＧＶＮＳ５核酸和氨基酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ 中ＨＧＶ 对应位置序列的同源性分别为８９．０％ ～９８．４％ 和９５．０％ ～９８．４％ ;河南株存在本地区的独特变异点（２３ 位Ａｌｇ→Ｇｌｙ,１１９ 位Ｐｈｅ→Ｌｅｕ ,１５３ 位Ａｓｐ→Ｇｌｕ） 。结论：ＨＧＶＮＳ５ 区基因相当保守,是ＰＣＲ方法检测ＨＧＶ的适宜扩增区段;推测这三个变异点可能是河南株ＨＧＶ 进化标志。     

含流感病毒M基因的DNA质粒诱导的抗甲型流感病毒保护性免疫

作者检测了含有Ａ ＰＲ 8 34流感病毒株Ｍ1和Ｍ2基因的表达质粒ｐＭＥ1 8Ｓ Ｍ的保护效力。　　ｐＭＥ1 8Ｓ Ｍ由表达质粒ｐＭＥ1 8Ｓ和流感病毒Ｍ区ｃＤＮＡ构建而成。Ｍ基因来源于流感病毒株Ａ ＰＲ 8 34,以ｐＭＥ1 8Ｓ空载体质粒作为阴性对照质粒。用于攻击的病毒Ａ ＷＳＮ 33(Ｈ1Ｎ1 )及Ａ ＰＲ 8 34(Ｈ1Ｎ1 )从感染的ＭＤＣＫ细胞中收获 ,并用空斑形成试验滴定对雄性ＢＡＬＢ ｃ小鼠 ( 6～ 8周龄 )鼻腔或肌肉注射途径免疫 3次 2 0 μｇＰＭＥ1 8Ｓ Ｍ ,每次间隔 2周。对阳性对照小鼠肌肉注射9.0× 1 0 7ＰＦＵ的灭活流感病毒Ａ ＰＲ 8 …     

前阿黑皮原和强啡肽原基因在自发性高血压大鼠脑内的表达

目的：检测前阿黑皮原（ＰＯＭＣ）和强啡肽原（ＰＰＤ）基因在高血压（ＳＨＲ）和同龄Ｗｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏ大鼠（ＷＫＹ）中的表达。方法：用地高辛（ＤＩＧ）标记的ＲＮＡ探针进行原位杂交检测ＰＯＭＣ ｍＲＮＡ和ＰＰＤ ｍＲＮＡ。 结果：ＰＯＭＣｍＲＮＡ６主要表达于弓状核，而ＳＨＲ表达量大于ＷＫＹ。ＰＰＤ ｍＲＮＡ表达于海马、下丘脑、中脑中央灰质、孤束核、胸髓。在齿状回、孤束核、内侧视前区，ＳＨＲ ＰＯ     

Serum α_1-acid glycoprotein,sialic acid,and protein binding of disopyramide in normal subjects and cardiac patients

目的：研究日本人充血性心力衰竭（ＣＨＦ）和急性心肌梗塞（ＡＭＩ）病人对血清α１酸性糖蛋白（ＡＧＰ）、唾液酸（ＳＡ）浓度及ＡＧＰ与丙吡胺（Ｄｉｓ）结合的影响．方法：对正常人、ＣＨＦ及ＡＭＩ患者血清样本９７例，采用免疫化学法测定ＡＧＰ浓度，高效液相层析法测定ＳＡ浓度及超滤膜技术和高效液相层析法测定Ｄｉｓ的体外游离浓度．结果：ＣＨＦ及ＡＭＩ患者血清ＡＧＰ浓度较正常人升高．Ｄｉｓ药物游离浓度降低．血清ＳＡ浓度的变化与血清ＡＧＰ浓度的变化趋势一致．结论：ＣＨＦ和ＡＭＩ病人血清药物游离浓度受血清ＡＧＰ结合的影响而变化，应进行临床监测．     

正常人和心脏病患者血清α1—酸性糖蛋白,唾液酸及丙吡胺蛋白…

目的：研究日本人充血性心力衰竭（ＣＨＦ）和急性心肌梗塞（ＡＭＩ）病人对血清α１－酸性糖蛋白（ＡＧＰ）、唾液酸（ＳＡ）浓度及ＡＧＰ与丙吡胺（Ｄｉｓ）结合的影响。方法：对正常人、ＣＨＦ及ＡＭＳ患者血清样本９７例，采用免疫化学法测定ＡＧＰ浓度，高效液相层析法测定ＳＡ浓度及超滤膜技术和高效液相层析法测定Ｄｉｓ的体外游离浓度。结果：ＣＨＦ及ＡＭＩ患者血清ＡＧＰ浓度较正常人升高。Ｄｉｓ药物游离浓度降低。血清Ｓ     

恶性淋巴瘤诊断中荧光原位杂交分析基因状态的研究

目的 探讨恶性淋巴瘤中基因重排的特点.方法 回顾性分析87例恶性淋巴瘤组织样本,利用荧光原位杂交技术,分别检测弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤中BCL-6、BCL-2、MALT1、CCND1、C-MYC和ALK基因重排.结果 弥漫大B细胞性淋巴瘤中BCL-6基因重排的阳性率为29.03％(9/31),滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排的阳性率为61.11％(11/18),黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排的阳性率为47.37％(9/19),套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排的阳性率为88.88％(8/9),Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排的阳性率为100％(2/2)和间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排的阳性率为75.00％(6/8).结论 基因重排对恶性淋巴瘤的诊断具有重要的实际价值.     

精蛋白在改进非病毒载体基因转染中的应用

非病毒基因载体的出现,为基因治疗提供了低毒、易于大规模制备的载体。但与病毒载体相比,非病毒基因载体的转染效率仍然偏低,阻碍了非病毒基因载体的临床应用。本文旨在探讨精蛋白在改进非病毒基因载体方面的应用,希望通过合理的载体设计与优化,制备出一种高效、低毒的基因载体。     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用

采用1个载体编码2个shRNA技术, 构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体, 研究其对人大肠癌细胞生长协同抑制的增效作用。构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体并转染大肠癌细胞, 通过RT-PCR和Western blotting方法检测Livin基因与Survivin基因的表达, 利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。经酶切鉴定和测序分析证实Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功, 它对大肠癌细胞Livin和Survivin mRNA的抑制率分别为27.90%和32.24%, 对Livin和Survivin蛋白表达的抑制率分别为22.28%和40.86%, 诱导肿瘤细胞凋亡率为 (11.69 ± 1.37) %, 但协同干扰作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功并能抑制Livin基因和Survivin基因的表达, 但协同抑制作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。     

Future prospects for gene delivery systems

Introduction: Gene therapy is the challenging area of biotechnology. Despite its promise for critical diseases, it has serious safety and efficiency issues, particularly with regards to gene transfer systems.

Areas covered: We examined the current situation with gene transfer systems and addressed problems this technology. We then searched patent applications about in the area from the Patentscope online system, the international patent database. We analyzed the data obtained to get a general idea about gene delivery systems designed for future use and assessed approaches for more efficient, safer and valid delivery systems.

Expert opinion: When quality assurance terms are fulfilled, some of these issues (genetic changes, mutations) could be minimized during the production process. Modification of vectors for improving their efficiency and safety or development of alternative transfer systems could be the solutions for these problems. Gene transfer technologies are important for gene therapy and should demonstrate effective, target-specific and acceptable safety profiles. For this reason, searching for alternatives to current systems is a necessity.     

激活沉默基因以获取抗生素的发展动态

随着基因工程技术的不断发展和成熟,通过遗传学途径筛选新抗生素和新活性物质的方法不断出现.本文综述了采用基因工程手段激活沉默基因以开发新型抗生素和活性物质的发展动态.较为具体的介绍了两个采用此种方法取得成功的实例,为今后的科研工作提供参考.     

肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD，pH2／UPRT的构建

目的利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应，构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD和pH2／UPRT。方法用PcR的方法从质粒pGEX／CD和pGEX／UPRT中扩增出CD基因和UPRT基因，用内切酶BamHI和SalI酶切CD基因，UPRT基因和质粒pH2，分别连接后重组于大肠杆菌中。用电转化的方法将重组质粒转人婴儿双歧杆菌中。通过双酶切和基因测序的方法检验质粒pH2／CD和pH2／UPRT的正确性，RT—PCR检测该系统的mRNA表达。在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果成功地将CD基因和UPRT基因转入了乳酸菌表达质粒pH2，在纯化后的质粒被双酶切后，CD基因被分割为6．9kb和1．3kb的两部分，UPRT基因被分割为6．9kb和620bp的两部分。CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致。RT—PCR检测到CD和UPRTmRNA的明显表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明pH2／CD，pH2／UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的强大杀伤作用。结论肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD，pH2／UPRT构建成功并显示出强大的杀伤肿瘤细胞的作用。     

RT-PCR检测胃癌NY-ESO-1抗原的表达及其基因克隆

目的 研究NY-ESO-1基因在胃癌中的表达,以便了解胃癌患者是否可以使用NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法 采用RT-PCR方法检测NY-ESO-1基因在60例胃癌组织和相应的癌旁正常组织中的表达,采用分子克隆的方法从胃癌组织中克隆了NY-ESO-1 cDNA。结果 NY-ESO-1基因在胃癌组织中的表达率为55％(33／60),在相应的癌旁正常组织中未见表达,克隆的NY-ESO-1 cDNA序列与GenBank报道一致。结论 NY-ESO-1基因在胃癌中呈高表达率,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CIL识别。     

福建地区汉族健康人群维生素D受体基因TaqI多态性分析

目的了解福建地区汉族健康人群维生素D受体（VDR）基因单核苷酸多态性位点分布特点。方法抽取福建地区汉族健康人79例,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应法（PCR-RFLP）测定VDR基因TaqI酶切位点多态性分布。结果 VDR基因TaqI酶切位点有两种基因型,TT、Tt两种基因型分布频率分别为81.01%、18.99%。T等位基因频率占90.51%,t等位基因频率占9.49%。基因型频率分布符合Hardy-weinberg平衡定律（χ^2=0.87,P〉0.05）,具有群体代表性。结论福建地区汉族健康人群VDR基因TaqI酶切位点多态性的分布与其他地区人群的分布,存在差异,可能为种族差异及环境因素的基因频率发生变化。     

哮喘豚鼠嗜酸细胞凋亡与ICE、Fas基因表达关系的研究

目的 探讨哮喘豚鼠EOS凋亡与ICE和Fas基因表达的关系。方法 实验分为哮喘组和正常对照组,各15只豚鼠,采用原位细胞凋亡方法检测豚鼠BALF中EOS的凋亡率;应用免疫细胞化学方法检测豚鼠肺组织的ICE和Fas基因表达。结果 哮喘组EOS凋亡率为2.1％±1.3％,显著低于对照组10.1％±1.4％(P<0.01)。哮喘组ICE、Fas基因表达强度分别为21±5和17±6,对照组分别为36±8和38±9,哮喘组显著低于对照组(P<0.01)。哮喘组EOS凋亡率与ICE和Fas基因表达呈正相关(r=0.65和0.68,P<0.05)。结论 哮喘豚鼠肺组织的ICE、Fas基因表达均降低,可能在抑制哮喘EOS凋亡中起重要作用。