研制甲型和乙型肝炎疫苗的新途径

乙型肝炎（ＨＢ）血源疫苗和酵母重组疫苗预防ＨＢ病毒（ＨＢＶ）感染已获满意效果，然而，无应答或低应答现象不仅发生于肥胖、肾功能衰竭或免疫抑制者，亦可见于健康者，因此，有必要研制免疫原性较强的ＨＢ疫苗。目前使用的重组ＨＢ疫苗系Ｓ基因编码的２２６个氨基酸产物装配而成的抗原颗粒，由于前Ｓ基因编码的蛋白已结合在ＨＢＶ包膜内，因此，前Ｓ基因产物至少在理论上可增强ＨＢ疫苗的保护作用。甲型肝炎（ＨＡ）灭活疫苗比目     

单纯疱疹疫苗—为何抗体不起保护作用？

研究表明,２型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－２）亚单位疫苗可提供抗ＨＳＶ－２相关疾病的保护作用,但不能抵抗ＨＳＶ－２感染。新疫苗策略包括研制能激发细胞和体液免疫应答的活病毒突变株和ＤＮＡ疫苗,此外,疫苗必须能诱导较强的粘膜免疫应答。     

单纯疱疹疫苗──为何抗体不起保护作用?

研究表明,２型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－２）亚单位疫苗可提供抗ＨＳＶ－２相关疾病的保护作用,但不能抵抗ＨＳＶ－２感染。新疫苗策略包括研制能激发细胞和体液免疫应答的活病毒突变株和ＤＮＡ疫苗,此外,疫苗必须能诱导较强的粘膜免疫应答。     

狂犬病病毒基因工程活疫苗

作者将源于狂犬病疫苗ＳＡＤＢ1 9的非致病株ＳＮ 1 0的Ｇ基因分别用银麾蝙蝠相关街毒株ＳＨＢＲＶ 1 8及固定毒ＣＶＳ2 4来源的ＣＶＳ Ｎ2ｃ、ＣＶＳ Ｂ2ｃ的Ｇ基因取代 ,产生三种重组病毒Ｒ ＳＨＢ1 8、Ｒ Ｎ2ｃ和Ｒ Ｂ2ｃ。与亲本株相比其毒力显著减弱 ,但Ｒ Ｎ2ｃ和Ｒ Ｂ2ｃ接种小鼠仍有致病性。将其Ｇ蛋白 333位精氨酸突变成谷氨酰胺产生Ｒ Ｎ2ｃ 333和Ｒ Ｂ2ｃ 333,与亲本株相比ＳＮ 1 0 333完全没有致病性 ,Ｒ Ｂ2ｃ 333的毒力剧减 ,而Ｒ Ｎ2ｃ 333的毒力没有改变。进一步将Ｒ Ｎ2ｃ的Ｇ蛋白胞浆区用ＳＨＢ1 8的相应部分取代后产生…     

新核苷类似物MCC-47对野生型或拉米夫定耐药的乙肝病毒的有效性

随着拉米夫定的长期使用 ,在聚合酶基因上发生Ｌ5 2 8突变 ,和 /或Ｍ 5 5 2Ｖ突变和Ｍ 5 5 2Ｉ突变的耐药性乙肝病毒 (ＨＢＶ)已成为临床上一个非常严重的问题。Ｏｎｏ -Ｎｉｔａ等研究了野生型和对拉米夫定耐药的ＨＢＶ对ＭＣＣ - 478(ＬＹ5 82 5 6 3)的敏感性。野生型ＨＢＶ和拉米夫定耐药的突变体 (Ｍ 5 5 2Ｉ ,Ｍ 5 5 2Ｖ和Ｌ5 2 8Ｍ /Ｍ 5 5 2Ｖ)对ＭＣＣ - 478的敏感性可由全长的ＨＢＶＤＮＡ暂时转染进入人体肝细胞瘤细胞内的方法测定。ＨＢＶＤＮＡ复制由Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｅｔ杂交法监测降低复制所需的半数有效浓度 (ＥＣ50 )。…     

作为EBV亚单位疫苗的EBV gp350单链糖蛋白的表达

由于ＥＢ病毒（ＥＢＶ）糖蛋白ｇp３５０／２２０是人类自然感染后ＥＢＶ中和抗体的主要攻击目标，并且在动物模型中已显示某些形式的ＰＰ３５０／２２０可抵抗ＥＢＶ相关疾病，因此，ＰＰ３５０／２２０有可能成为候选的ＥＢＶ亚单位疫苗。ＰＰ３５０／ｇｐ２２０是由单一基因在转录ｍＲＮＡ时因剪接不同而产生的两种蛋白产物，分子量分别为３５０ｋＤ和２２０ｋＤ。以往的研究已表明两者的不同配比影响疫苗的保护效果，为此作者经过突变、缺失等方法，在中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞系中只分泌表达ｇＰ３５０，并有效抑制ｇｐ２２０的表达…     

HCVNS5B区序列克隆和重组质粒的构建

选ＨＣＶ２ｂ基因型的ＮＳ５Ｂ区序更合成引的，以ＲＴ－ＰＣＲ从慢性丙肝病人血清中扩增一段４０１ｂｐ的ｃＤＮＡ片断作目的基因，插入ｐＴＤ－Ｔ７的多克隆位点，构建了重组质粒ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ。应用ＥＣＯＲＩ ＢａｍＨＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，酶切片断的分子量与预期相符。用载体序列特异的通用引物进行测序分析证实ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ中克隆基因是ＨＣＶ２ｂ的ＮＳ６Ｂ６序列，且为正方向插入。     

6例河南株HGV NS5基因变异的研究

目的：探讨河南省庚型肝炎病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴＮｅｓｔＰＣＲ） 扩增ＨＧＶＮＳ５ 区序列;将ＰＣＲ扩增产物克隆入Ｔ载体,进行测序和分析。结果：河南株ＨＧＶＮＳ５核酸和氨基酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ 中ＨＧＶ 对应位置序列的同源性分别为８９．０％ ～９８．４％ 和９５．０％ ～９８．４％ ;河南株存在本地区的独特变异点（２３ 位Ａｌｇ→Ｇｌｙ,１１９ 位Ｐｈｅ→Ｌｅｕ ,１５３ 位Ａｓｐ→Ｇｌｕ） 。结论：ＨＧＶＮＳ５ 区基因相当保守,是ＰＣＲ方法检测ＨＧＶ的适宜扩增区段;推测这三个变异点可能是河南株ＨＧＶ 进化标志。     

聚合酶链反应对慢性乙肝病毒感染者血清HBVC与S基因的研究

用聚合酶链反应方法对１３８例慢性肝病和无症状乙肝病毒表面抗原携带者进行血清ＨＢＶＣ与Ｓ基因片段的扩增，发现Ｓ基因的检出率为６６．７％，高于Ｃ基因（５２．９％）。Ｃ与Ｓ基因的检出结果在ＨＢｅＡｇ阳性病例中，基本一致；在ＨＢｅＡｇ阴性病例中，Ｓ基因明显高于Ｃ基因（分别为５１．３％与３０．８％），有２０％左右的病例呈现单一基因阳性。Ｃ加Ｓ基因的检出率在ＨＢｅＡｇ阳性的慢性肝病及ＡＳＣ中相同，均为１００％     

乙型肝炎前S1抗原的检测与病毒标志物的关系及临床意义

前Ｓ１ 蛋白为乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)前Ｓ１ 基因的编码产物 ,是ＨＢＶ外膜蛋白中的大分子ＨＢｓＡｇ的组成部分。近年的研究表明［１］,前Ｓ１ 抗原 (Ｐｒｅ -Ｓ１Ａｇ)与病毒的感染性复制有密切关系 ,可作为判断ＨＢＶ感染者是否有病毒活动和较大传染性的新标志。现就Ｐｒｅ-Ｓ１Ａｇ,ＨＢＶ—ＤＮＡ与其标志物 (ＨＢＶ—Ｍ)之间的关系、临床意义作一探讨。１材料和方法１ １检测对象 :收集我院检测ＨＢＶ—Ｍ标本共１３５例 ,其中ＨＢｓＡｇ（ +）、ＨＢｅＡｇ（ +）、ＨＢｃＡｇ（ +）的乙肝患者４５例 ,ＨＢ ｓＡｇ（ +）、ＨＢｅＡｂ…     

Clinical evaluation of oligonucleotide microarrays for the detection of HBV mutants associated with lamivudine resistance

OBJECTIVES: Long-term lamivudine administration in hepatitis B virus (HBV)-infected patients induces the emergence of HBV mutants with lamivudine resistance. The aim of the present study was to evaluate the clinical application of an oligonucleotide microarray in detecting HBV mutants associated with lamivudine resistance. METHODS: 947 HBV DNA-positive sera from: 388 patients receiving lamivudine treatment, 559 chronic hepatitis B patients not receiving lamivudine treatment, and 359 from HBV DNA-negative controls, were assayed for HBV mutations using the oligonucleotide microarray. Furthermore, follow-up studies were performed using 255 clinical samples from 51 patients treated with lamivudine at various periods. The results were compared with sequencing and real-time polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: The HBV DNA polymerase Tyr-Met-Asp-Asp motif (YMDD) mutation was detected in all 388 samples containing lamivudine-resistant mutations identified by microarray. For the codons rt180, rt204 and rt207, the agreements between the microarray and sequencing data are 96.6, 98.5 and 100%, respectively. Two previously unreported mutants were also found in those samples. In the 947 samples collected from different patients, which were detected positive for HBV DNA by quantitative PCR, all but three weak-positive samples were positive by the microarray, demonstrating an agreement of 99.7%. In all the positive samples, mutations could be detected in the relevant loci of HBV DNA polymerase with lamivudine resistance. All of the 359 HBsAg-negative samples were shown to be negative for HBV DNA using the microarray method. Follow-up detection of the clinical samples from 51 patients treated with lamivudine demonstrated that the microarray method was able to detect mutations in mixed viruses that were infecting prior to sequencing. CONCLUSION: The oligonucleotide microarray can be conveniently utilized to detect mutant HBV in clinical serum samples.     

核苷类药与慢性HBV感染者病毒P基因准种及变异特点的关系

目的观察核苷类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙肝病毒聚合酶(HBV P)基因准种变化及变异特点。方法运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,按照Pyro-Mark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物(HBV P基因相关位点)的焦磷酸测序和突变频率检测。108例慢性HBV感染患者中用药史明确者同期测定HBV DNA、HBV标志物、ALT。结果108例患者中,61例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,有少量V173L、S202G、T184G突变;其中40例用药史明确患者中,18例发生变异,发生变异者耐药突变型在样本中所占比例为20%-100%,HBV P基因变异可以在HBV DNA、ALT发生突变前、中、后检出。结论焦磷酸测序可以快速检测HBV P基因变异;变异株突变频率变化可初步反映HBVP基因准种异质性;HBV P基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关。     

石家庄地区乙型肝炎病毒基因分型及P区耐药基因突变分析

目的:分析石家庄地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布以及核苷(酸)类似物耐药基因突变状况。 方法:对2011年1月-2013年12月在石家庄市五医院就诊的遵医嘱口服核苷(酸)类似物6个月以上的354例慢性乙型肝炎患者进行HBV P区基因序列测定。结果:HBV B型为17例(4.8%),C型为337例(95.2%);共检出突变182例,在B型中检测出有10例突变(58.8%),在C型中检测出有172例突变(51.1%),两组间突变率无显著差别;182例HBV P区存在突变的病例中以rtL180M+rtM204I/V/S联合突变最多,占突变比例24.2%;其次是rtM204I/V/S单位点突变,占突变比例20.3%,这两种突变模式的比例达到44.5%;第3位是rtL180M+rtM204I/V/S 再加上其他一个或多个位点的突变,占突变比例12.6%。结论:石家庄地区HBV基因型以C型为主;核苷(酸)类似物耐药基因突变以拉米夫定和替比夫定耐药最常见。     

慢性无症状乙型肝炎病毒携带者的基因型研究

目的：采用多对型特异性引物，通过巢式PCR检测慢性HBV无症状携带者中的HBV基因型分布情况。方法：根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物，并将其中8条内引物分成2组，分别扩增A，B，C和D，E，F型，根据PCR产物大小判定HBV基因型。用此方法检测北京地区HBV慢性无症状HBV携带者血清。结果：265例慢性无症状HBV携带者中，HBV DNA阳性113例，阳性率42．6％。检测到B，C基因型分别为B基因型29例（25．7％），C基因型80例（70．8％），B基因型和C基因型混合感染4例（3．5％）。不同基因型在不同性别构成比例和HBeAg阳性率的差别无统计学意义。结论：北京地区慢性无症状HBV携带者HBV DNA阳性患者中以B，C型为主，C型占优势，存在少量B和C基因型混合感染。     

早发性帕金森病Parkin基因突变研究

目的：研究早发性帕金森病患者Parkin基因的突变情况，并分析Parkin基因突变对其功能的影响。方法：以40例早发性帕金森病患者和100例正常人为研究对象，提取基因组DNA，扩增Parkin基因的7对外显子，并用单链构象多态性（SSCP）的方法分析Parkin基因的缺失突变和点突变情况。结果：2例患者外显子4缺失．1例患者外显子2缺失，1例患者外显子7发乍G951C突变。正常人中未发现外显子缺失和点突变。结论：Parkin基因突变是早发性帕金森病患者发病原因之一。     

Single mutations at Asn295 and Leu305 in the cytoplasmic half of transmembrane alpha-helix domain 7 of the AT1 receptor induce promiscuous agonist specificity for angiotensin II fragments: a pseudo-constitutive activity

The most striking feature of a G protein-coupled receptor (GPCR) is its highly exclusive agonist specificity. This feature guarantees that a GPCR recognizes only its specific native agonist(s). In this study, we showed that two point mutations of N295S and L305Q enabled the AT(1) receptors to recognize multiple Ang II fragments. Similar to the well established constitutively active AT(1) mutant receptor N111G, the mutations of N295S and L305Q induced an increased production of basal inositol 1,4,5-phosphates in the absence of exogenous Ang II when expressed in HEK293 cells. Distinct from the N111G, however, is the fact that the increased basal activity disappeared in COS-7 cells because of the lack of endogenous Ang II fragments produced by the cells-a pseudo-constitutive activity. It is surprising that the Ang II analog [Sar(1),Ile(4),Ile(8)]Ang II and the native angiotensin II fragments Ang 1-7, Ang IV, and Ang 5-8, which are inactive in activating the wild-type receptor, activated N295S and L305Q. Results generated by lowering the Na(+) concentration suggest that the mutant N295S and L305Q may be trapped in neutral conformational states (R(N)). These data allow us to identify for the first time a novel pattern of GPCR mutations with a broad spectrum of agonist specificity, suggesting possible existence of functional GPCRs in nature that are activated through conformational "selection" rather than "induction" mechanisms.     

乙型肝炎患者血清HBV前C区A83变异株的检测

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C区A83点突变与临床关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)对64例乙型肝炎(乙肝)患者HBV前C区基因进行扩增,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),鉴定前C区第83位核苷酸点突变。结果:34例(53.13%)有A83点突变,其中12例(18.75%)为单独变异株感染,22例(34.38%)为变异株与野毒株混合感染。慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)组高于无症状HBV携带者(ASC)(P<0.05)。抗-HBe( )组的检出率为70.0%,高于HBeAg( )组的25.0%(P<0.01),并且随着HBVDNA含量的增高,其发生变异的可能性越大(P<0.05)。结论:前C区A83点突变的发生可能与机体长期的炎症活动、免疫压力的选择有关。     

乙型肝炎病毒YMDD变异株的检测及临床意义

目的：建立乙型肝炎病毒P区基因直接测序方法，进一步了解口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者HBVP区发生YMDD变异的情况，并探讨其相关影响因素。方法：应用聚合酶链反应（PCR）扩增HBVDNAP基因区，通过直接测序方法与Genebank标准序列对比，对107例慢性乙肝（CHB）患者血清进行P区测序。结果：107例慢性乙肝患者YMDD变异率为32．7％，其中YIDD变异17例，YVDD变异15例，混合变异3例。YMDD未变异组治疗前谷丙转氨酶（ALT）水平显著高于变异者；而YMDD变异组治疗前HBVDNA含量显著高于未变异组；YMDD未变异组与变异组之间治疗前的患者性别、年龄和HBeAg状态等方面差异无统计学意义。结论：HBVYMDD变异可能与患者治疗前ALT水平和HBVDNA含量有一定关系．而与患者的性别、年龄和血清HBeAg状态无关。     

市售HBsAg检测ELISA免疫逃逸变异检测能力的再评价

目的考核现行市售ELISA试剂对野生及免疫逃逸变异HBsAg的检测能力。方法采用一组市售ELISA试剂对本室既往研制的高浓度与定值基因重组G145R变异HBsAg质控物，部颁血清HBsAgELISA检测质控物，多种乙肝病毒免疫逃逸变异重组S蛋白表达产物（细胞培养上清），以及一组经特殊选择的临床血清进行检测，并与既往有关检测资料进行比较。结果自制G145R变异HBsAg质控物与抗HBsG6mAb的结合能力较一年前降低40．7％，但仍保持留较为完好的免疫反应性。以此及部颁质控血清进行考核，10份市售试剂中6份对IEMHBsAg的检测能力与野生HBsAg相当（比较显色强度大于90．0％，相对应敏感指数大于0．5），3份试剂出现不同程度的降低（比较显色强度介于83．5％～50．7％，相对应敏感指数介于0．25～0．125），1份试剂仅表现出极弱的检测现象（比较显色强度为11．20％，相对应敏感指数0．0039）。采用ELISAI、J及L等试剂对一组临床标本进行检测，阳性率分别为6．23％、14．89％、19．21％，前者HBsAg检出率较后两者显著为低（P〈0．05及0．01），后两者阳性率间亦表现出显著的差异（P〈0．05）。结论现行国产试剂对IEMHBsAg检测能力较既往已大幅度提高，采用以单一G145R变异HBsAg制备的质控物仅能部分评价它们对IEMHBsAg的检测能力。