细胞自噬在甲氨蝶呤耐药绒癌中的保护性作用

目的：通过检测耐药绒癌细胞内自噬的变化,以及评估抑制自噬或敲除自噬相关基因后细胞凋亡情况,探讨细胞自噬在耐药绒癌中的作用。方法：以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的甲氨蝶呤（MTX）耐药绒癌JEG-3／MTXR细胞为研究对象。采用透射电镜、免疫荧光法观察MTX处理后细胞内自噬的变化;Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Bec]in-1的表达变化。RNA干扰法沉默自噬相关基因LC3后,采用Westernblot法和Annexin-V／PI双染法流式细胞仪检测MTX作用后JEG-3／MTXR耐药绒癌细胞凋亡的变化。结果：透射电镜和荧光显微镜下均可观察到MTX处理后JFG-3、JEG-3／MTXR细胞内自噬小体的产生;Icm浓度MTX处理后,两种细胞内自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达水平上调。相同浓度MTX处理后,JEG-3细胞内LC3、Beclin-1表达下调。沉默自噬相关基因LC3后,沉默LC3联合MTX组的JEG-3／MTXR和JEG-3细胞内凋亡相关蛋白caspase-9表达上调,凋亡率显著增多。结论：MTX可诱导耐药绒癌产生保护性自噬。     

内质网应激介导的凋亡耐受在甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制中的作用

目的:初步探讨内质网应激介导的凋亡耐受在甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制中的作用。方法:以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的甲氨蝶呤耐药绒癌细胞(JEG-3/MTXR)为研究对象。采用WST法评估甲氨蝶呤处理后JEG-3/MTXR和JEG-3亲本细胞的细胞活力,Western blot法测定两种细胞中caspase-9激活、GRP78和GADD153蛋白的表达。RNA干扰法沉默JEG/MTXR细胞中GADD153基因,Western blot法测定caspase-9蛋白激活的情况。结果:不同浓度梯度的甲氨蝶呤诱导后,JEG-3亲本细胞系的细胞生存率显著降低。相同浓度甲氨蝶呤作用后,JEG-3/MTXR细胞内切割caspase-9无增加,JEG-3亲本细胞内caspase-9激活并切割。JEG-3/MTXR和JEG-3细胞中GRP78表达水平呈时间依赖性上调;JEG-3/MTXR细胞中GADD153蛋白水平无显著上调,而JEG-3亲本细胞内出现显著上调。沉默GADD153基因可抑制MTX引起的切割caspase-9蛋白水平上调。结论:内质网应激介导的凋亡耐受可能参与甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制。     

绒癌细胞系中Fas/FasL的表达及免疫逃逸机制探讨

目的观察Fas/FasL系统在绒毛膜癌(绒癌)细胞系(JEG-3、BeWo)和T细胞系(Jurkat)中的表达,探讨Jurkat细胞凋亡的机制及Fas/FasL系统与人绒癌细胞免疫逃逸及反杀伤作用的关系。方法 RT-PCR检测绒癌细胞系JEG-3、BeWo与Jurkat细胞中Fas/FasL mRNA表达,免疫印迹实验检测3个细胞系中Fas/FasL的蛋白表达情况,台盼蓝拒染实验检测Jurkat细胞成活率,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与Jurkat细胞相比,在mRNA水平和蛋白水平,绒癌细胞中Fas表达低下,而FasL表达升高。绒癌细胞与Jurkat细胞共培养可诱导Jurkat细胞存活率下降,诱导凋亡(P0.05),随共培养时间延长Jurkat细胞凋亡率升高(P0.05)。结论绒癌细胞能抵抗Fas/FasL系统介导的凋亡,高表达的FasL可反击杀伤Fas+T细胞,低表达的Fas可以逃避T细胞的免疫杀伤。     

内质网应激激活与依托泊甙和放线菌素D耐药绒癌相关性研究

目的探讨内质网应激激活与拓扑异构酶Ⅱα介导的依托泊甙(etoposide,VP16)和放线菌素D(actinomy-cin-D,Act-D)耐药绒癌的关系。方法采用间断诱导法诱导人绒癌细胞系JEG-3,分别建立绒癌ActD耐药细胞系JEG-3/ActDB1和VP16耐药细胞系JEG-3/VPC1。细胞计数法(cell counting kit-8,CCK-8)观察敏感细胞和耐药细胞的生长增殖规律和耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期比例和染色体倍性变化;荧光定量PCR技术分别检测两种不同药物诱导的JEG-3耐药株中拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和内质网应激(ERS)各个通路相关的基因mR-NA的表达水平。结果 (1)成功建立了绒癌耐药细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3/VPC1。其耐药指数分别为50.64±10.68和65.87±3.19。耐药株生长速度均较亲本细胞减慢,三者的染色体倍性差异无统计学意义。(2)在两种不同的耐药株中,TopoⅡα的表达水平均明显低于亲本细胞,而与ERS各个通路相关基因均有不同程度的激活。结论成功建立了针对ActD和VP16耐药的绒癌细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3...     

绒癌耐药细胞系的建立及获得性耐药机制的研究

目的采用目前治疗绒癌最常用的药物诱导建立绒癌的耐药细胞系,比较不同药物引起耐药机制的差异.方法采用浓度梯度递增法和间歇诱导法,分别用5-FU,MTX,VP-16诱导绒癌细胞系JEG-3,建立相应耐药细胞系,采用MTT法测定耐药细胞系对5-FU、MTX、KSM、VP-16和Taxol的耐药指数,用RT-PCR测定亲本细胞及各耐药细胞系耐药相关基因如肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)、谷胱甘肽转移酶(GST-π)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和多药耐药基因(MDR-1)的mRNA表达,比较各种细胞生长曲线,细胞群体倍增时间.结果JEG-3细胞系在诱导耐药细胞前即有LRP、MRP、GST-π、DHFR的共表达,诱导耐药后上述各基因的表达无明显变化.诱导耐药前JEG-3细胞无MDR1的表达,用VP-16、5-FU间歇诱导的方法诱导形成的耐药细胞系有MDR-1表达,且耐药指数增加.结论JEG-3耐药细胞系耐药性的产生与MRP、LRP、GST-π、DHFR表达的关系不密切,而与MDR1的表达有关.     

甲氨蝶呤诱导人绒毛膜癌JAR细胞株凋亡及其相关蛋白的表达

甲氨蝶呤(MTX)是治疗绒毛膜癌(绒癌)的首选或在绝大多数联合化疗方案中必需的药物。随着对细胞凋亡研究的不断深入,发现MTX可诱导多种细胞凋亡而发挥其细胞毒作用。本研究使用流式细胞仪检测不同浓度MTX诱导发生于胎盘滋养细胞的绒癌细胞株JAR细胞的凋亡,并采用免疫细胞化学方法,检测与JAR凋亡细胞相关的p27^kipl、bcl-2、bax蛋白的表达,以探讨MTX诱导JAR细胞凋亡的机制。     

氧化应激条件下FoxO3a通过调控BNIP3影响滋养细胞自噬及凋亡

目的:探讨氧化应激条件下叉头框转录因子O3a(FoxO3a)参与人绒毛外滋养细胞自噬与凋亡的分子机制。方法:用葡萄糖氧化酶(GO)构建人绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo的氧化应激模型并经FoxO3a特异性siRNA处理,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测滋养细胞ROS和凋亡水平,荧光定量PCR法检测FoxO3a和BNIP3的mRNA水平,Western blot法检测FoxO3a、BNIP3和自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62蛋白表达水平。结果:与对照组相比,GO处理后细胞增殖活性下降,细胞内ROS含量增加,细胞内FoxO3a的mRNA和蛋白水平明显增高,FoxO3a磷酸化蛋白水平降低,自噬相关蛋白LC3II/LC3I、Beclin-1增强,p62蛋白水平降低(P0.05),凋亡增加(P0.05)。与阴性siRNA转染组相比,沉默FoxO3a后FoxO3a和BNIP3的mRNA和蛋白表达均明显降低,自噬相关蛋白LC3II/LC3I降低,p62蛋白表达增加(P0.05),Beclin-1蛋白表达变化不明显(P0.05),细胞凋亡减少(P0.05)。结论:在GO诱导的氧化应激下,FoxO3a可通过调控BNIP3诱导滋养细胞自噬和凋亡。     

ABCG2在人绒毛膜癌耐药细胞株中的表达研究

目的:研究多药耐药基因ABCG2在人绒毛膜癌亲本细胞株(JEG-3)及耐药细胞株(JEG-3/VP16)中的表达情况,探讨ABCG2在绒毛膜癌耐药性中所起的作用.方法:用逆转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)检测ABCG2的mRNA表达,用蛋白质印迹法(Western blot)检测ABCG2的蛋白质水平的表达,并采用流式细胞技术测试出两种细胞株中ABCG2阳性细胞的比例.结果:RT-PCR和Western blot结果显示:在JEG-3细胞及JEG-3/VP16细胞中均可检测到ABCG2mRNA和蛋白的表达,但JEG-3/VP16细胞中ABCG2 mRNA的表达(1.74±0.07)和蛋白的表达(1.13±0.09)水平要明显高于JEG-3细胞(0.86±0.06和0.64±0.05),差异有统计学意义(P＜0.01);流式细胞检测结果示:ABCG2在JEG-3/VP16细胞中的阳性表达率(50.66±3.82)％要明显高于在JEG-3细胞中的阳性表达率(14.78±1.02)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:ABCG2在耐药性人绒毛膜癌细胞株JEG-3/VP16中高表达,提示ABCG2可能参与了绒毛膜癌的耐药机制.     

钙网蛋白在甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌中的作用研究

目的:探讨钙网蛋白(CALR)在对甲氨蝶呤(MTX)耐药的人绒毛膜癌中的作用.方法:采用Western blot印迹和细胞免疫荧光方法检测CALR蛋白在对MTX间断诱导耐药绒毛膜癌细胞株JeG-3/MTXA1与亲本细胞JeG-3中的表达差异,观察利用RNA干扰(RNAi)技术干扰CALR表达后耐药细胞耐药指数的变化.结果:Western blot验证结果,CALR在耐药细胞JeG-3/MTXA1中的表达明显高于亲本细胞JeG-3.细胞免疫荧光结果,在耐药细胞JeG-3/MTXA1中,CALR蛋白表达明显较亲本细胞JeG-3增多,且近核表达增强.经过RNAi后,耐药细胞JeG-3/MTXA1的耐药指数下调74.05％ (33.94±0.68 vs 8.81±1.58),而对细胞增殖无明显影响.结论:CALR蛋白在耐药细胞中明显上调,干扰其表达后耐药细胞可明显降低其耐药指数.CALR可能参与对MTX耐药绒毛膜癌的发生.     

二氢叶酸还原酶在两种不同方式诱导的甲氨蝶呤耐药绒癌细胞系中的动态表达

目的:用间断和连续两种诱导方式建立对甲氨蝶呤(MTX)耐药的绒毛膜癌细胞系,并动态检测二氢叶酸还原酶(DHFR)在两种耐药细胞系建立过程中的表达。方法:采用间断和连续诱导法诱导人绒癌细胞系JeG-3,分别建立绒癌MTX耐药细胞系MTXA1(间断诱导浓度为1.1×10-3mol/L)和MTXC2(连续诱导浓度为1.1×10-5mol/L)。细胞计数法(CCK-8)观察耐药细胞的耐药指数;化学发光法和荧光定量PCR技术分别检测不同诱导方法和不同浓度MTX诱导的JeG-3细胞中β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和DHFR mRNA的表达水平。结果:(1)历时1年成功建立了绒癌耐药细胞系MTXA1和MTXC2,其耐药指数分别为21.36和28.84;(2)β-HCG分泌和DHFR mRNA表达水平在间断和连续两种不同诱导方式诱导的绒癌细胞株中呈相同的动态变化趋势:经低浓度MTX诱导后,JeG-3细胞中β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达水平上调;但当MTX诱导浓度增加到一定剂量时,两者不再继续上调而呈下降趋势。结论:成功建立了间断和连续两种方式诱导的耐药绒癌细胞系MTXA1和MTXC2。绒癌细胞β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达与MTX作用浓度以及耐药性无明显的正相关关系。目前的研究结果表明,DHFR mRNA的表达水平不适宜作为绒癌细胞是否对MTX耐药的指标。     

乙酰肝素酶与绒毛膜癌侵袭能力的关系

目的 通过研究乙酰肝素酶（Hpa）在绒毛膜癌高、低侵袭力细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达情况,探讨Hpa与绒毛膜癌侵袭能力的关系。方法 通过Matrigel体外侵袭实验检测不同侵袭力绒毛膜癌细胞系JEG-3和JAR的体外侵袭能力;应用免疫细胞化学方法及蛋白印迹法（westem blot）检测Hpa蛋白在不同绒毛膜癌细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达,并进行相关性分析。结果 （1）JEG-3细胞的穿膜细胞数[（191±17）个]较JAR细胞的穿膜细胞数[（106±13）个]明显增多,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞JEG-3、JAR中均有表达,且主要定位于细胞质。（3）在正常早孕绒毛组织、JEG-3细胞和JAR细胞中均可检测到Hpa蛋白,JEG-3细胞中Hpa蛋白的表达量（1．560±0．180）明显高于JAR细胞Hpa蛋白的表达量（0．610±0．170）,绒毛膜癌细胞系中Hpa蛋白的表达量又显著高于正常早孕绒毛组织Hpa蛋白的表达量（0．190±0．008）,两两比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）相关性分析显示,Hpa蛋白的表达量与绒毛膜癌细胞体外侵袭能力呈正相关关系（r=0．89,P〈0．05）。结论 Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞中表达较正常绒毛组织高;Hpa蛋白在滋养细胞中的表达随滋养细胞侵袭能力的增加其表达上调;滋养细胞产生过量的Hpa对基底膜蛋白的水解作用在绒毛膜癌的侵袭、转移中发挥重要作用。     

乌司他丁通过调节uPA表达对绒癌细胞体外侵袭能力的影响

目的:探讨尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)乌司他丁(Ulinastatin)对绒癌细胞侵袭力的影响及其作用机制。方法:Matrigel体外侵袭实验比较绒癌细胞JEG-3和JAR的体外侵袭能力及不同浓度乌司他丁对JEG-3细胞体外侵袭能力的影响,半定量RT-PCR法检测两种细胞内uPA mRNA表达及不同浓度乌司他丁对JEG-3细胞中uPA mRNA表达的影响。结果:JEG-3细胞体外侵袭能力(201±21)明显强于JAR细胞(106±18),两者差异有统计学意义(P0.001);细胞内uPA mRNA表达JEG-3(0.3835±0.01255)明显高于JAR(0.1057±0.01664),两者差异有统计学意义(P0.01);在本实验的浓度范围内,乌司他丁浓度达100U/ml及以上时,各组JEG-3细胞中uPA mRNA表达水平、穿膜细胞数与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05),不同浓度组间差异亦有统计学意义(P0.05),uPA mRNA表达水平、穿膜细胞数与药物浓度之间呈负相关(r=-0.862,P0.05;r=-0.885,P0.05);细胞侵袭力与细胞中uPA mRNA表达水平呈正相关(r=0.996,P0.05)。结论:uPA可能是与绒癌侵袭转移相关的基因,UTI可通过下调uPAmRNA表达抑制绒癌JEG-3细胞的体外侵袭转移。     

转导人肿瘤坏死因子α基因对耐药性绒毛膜癌裸鼠移植瘤耐药性的逆转作用

目的　探讨转导人肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor α,TNF α)基因 ,对耐药性绒毛膜癌 (绒癌 )裸鼠移植瘤耐药性的逆转作用。方法　将绒癌细胞系JEG 3(A细胞系 )、耐药性绒癌细胞系JEG 3/VP2 (B细胞系 )和转导TNF α基因的耐药性绒癌细胞系JEG 3/VP2 /TNF α(C细胞系 )接种于裸鼠颈背部皮下 ,建立绒癌裸鼠移植瘤模型。每种细胞系移植瘤模型均分为对照组 (腹腔注入生理盐水 )和化学药物治疗 (化疗 )组 [腹腔注入鬼臼乙叉甙 (VP 1 6) ] ,观察移植瘤的生长特点、组织学结构以及对化疗药物的敏感性 ;用逆转录聚合酶链反应方法和免疫组织化学方法 ,检测转导TNF α基因的耐药性绒癌裸鼠移植瘤中多药耐药 (multidrugresistance ,MDR1 )基因在mRNA和蛋白水平表达的改变。结果　移植成瘤率均为 1 0 0 % ,潜伏期 1 0～ 1 4d ;移植瘤组织学特征符合绒癌特点 ;C细胞系移植瘤的生长速度最慢 ,明显低于A、B两个细胞系的生长速度 (P均 <0 0 5) ;C细胞系对照组裸鼠的移植瘤[体积 (4 2± 0 5)cm3,重量 (0 95± 0 1 2 )g]比B细胞系对照组 [体积 (7 9± 0 3)cm3,重量 (1 60± 0 0 6)g]明显减少 (P <0 0 5) ,应用同样剂量的化学药物作用后 ,C细胞系化疗组肿瘤的抑制率 (41 0 %～42 5 % )接近A细胞系化疗组 (46     

PI3K/PKB信号激活在妊娠滋养细胞疾病发病机制中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信号激活对妊娠滋养细胞疾病(GTD)进展及相关干细胞转录因子FoxD3、Nanog、Stat3、Oct4和Sox2表达的影响。方法:选取20例正常胎盘、38例良性转归葡萄胎(HM-regressed)和13例恶性进展葡萄胎(HM-progressed)、6例绒癌的石蜡包埋组织,采用免疫组化检测p-PKBSer473表达。实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot法检测绒癌细胞株JEG3和JAR中FoxD3、Nanog、Stat3、Oct4和Sox2 mRNA和蛋白表达。CCK8和Transwell小室检测细胞增殖、迁移/侵袭能力。结果:p-PKBSer473表达的免疫组化评分由高到低依次为绒癌、HM-progressed、HM-regressed和正常胎盘,两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。PI3K抑制剂LY294002阻遏了PKB的活化,显著减弱了绒癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,降低了FoxD3、Nanog、Stat3的mRNA和蛋白表达,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:PI3K/PKB信号通道激活与GTD的进展和侵袭表型有关,可通过增强调控滋养细胞的干细胞特性而发挥作用。     

GTT1/StarD7, a novel phosphatidylcholine transfer protein-like highly expressed in gestational trophoblastic tumour: cloning and characterization

We report the cDNA cloning and characterization of GTT1/StarD7, a novel gestational trophoblastic tumour gene, initially identified by its up-regulated expression in the choriocarcinoma JEG-3 cell line with respect to their nonmalignant counterpart, complete hydatidiform mole and normal trophoblastic tissue. Using the differential display fragment as a probe we screened placenta and HeLa cDNA libraries and isolated a clone carrying a 3315 bp insert (accession number AF270647). This cDNA encodes a protein of 295 amino acid residues with a molecular weight of approximately 34.7 kDa and a pI of 5.79. Computer-mediated homology search revealed that the deduced amino acid sequence had similarity to phosphatidylcholine transfer protein (PCTP) with a conserved StAR-related lipid transfer (START) domain extending between the amino acids 66 to 250. The GTT1 gene contains at least 9 exons spread nearly 30 kb on chromosome 2p12-2p11.2. Northern blot assays of total RNA derived from normal early placenta (NEP), complete hydatidiform mole (CHM) and JEG-3 cell line revealed a 3.5 kb mRNA expressed exclusively in the JEG-3 cell line. However, semiquantitative RT-PCR analysis performed with the same RNA samples demonstrated GTT1 expression throughout all of them with the highest level in JEG-3 cell line. Examination of GTT1 mRNA expression by semiquantitative RT-PCR assays in a series of tumour cell lines indicated wide-spread GTT1 expression with predominance in both choriocarcinoma JEG-3 and JAR cells, colorectal adenocarcinoma HT29 and hepatocellular carcinoma HepG2 cells. In conclusion, the highly GTT1 expression profile in JEG-3 and JAR cell lines and its lipid binding domain suggest that GTT1 may play an important role in the phospholipid-mediated signalling of trophoblastic tumour cellular events.     

小分子干扰RNA对绒毛膜癌细胞人类白细胞抗原G 基因表达的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)对绒毛膜癌(绒癌)细胞中人类白细胞抗原G(HLA-G) 基因表达的影响,了解HLA-G基因在绒癌发生、发展中的作用.方法设计并合成HLA-G siRNA,分为两组.实验组以不同浓度(分别为1.0、 2.5、 5.0 μg/L,下同)的HLA-G siRNA转染HLA-G基因高表达的绒癌细胞系JEG-3细胞,对照组以等量阴性对照siRNA转染JEG-3细胞.实时荧光定量RT-PCR技术检测转染后JEG-3细胞中HLA-G mRNA的表达,HLA-G mRNA的表达以PCR循环数阈值(Ct值)表示;蛋白印迹法测定JEG-3细胞中HLA-G蛋白的表达;显微镜观察并计数转染后存活的JEG-3细胞数.结果 HLA-G siRNA转染JEG-3细胞后,明显下调JEG-3细胞中HLA-G mRNA及蛋白的表达水平.实验组不同浓度的HLA-G siRNA转染后,JEG-3细胞的Ct值[分别为(20.67±0.02)、(21.37±0.03)、(21.43±0.02)个循环数],分别与对照组[分别为(20.33±0.01)、(20.37±0.02)、(20.40±0.03)个循环数]比较,差异有统计学意义(P<0.05).上述浓度转染后,实验组JEG-3细胞的HLA-G蛋白表达水平[分别为0.42±0.03、0.37±0.02、0.12±0.04],分别与对照组[分别为1.69±0.23、1.62±0.31、1.36±0.22]比较,差异有统计学意义(P<0.01).实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制(P<0.05).结论 HLA-G siRNA可以下调HLA-G mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞生长,表明HLA-G基因在绒癌的发生、发展中具有重要作用.