人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3-luc裸鼠皮下及原位移植瘤模型的建立与研究

目的:建立整体可视化人卵巢癌皮下和原位移植瘤模型,用于实时观察和分析人卵巢癌移植瘤发展和转移的规律,并比较两者的成瘤情况及生物学特性。方法:使用带有荧光素酶报告基因(Luciferase)的人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3-luc分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下和左侧卵巢内,建立人上皮性卵巢癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型。实时观察卵巢癌细胞SKOV3-luc在裸鼠皮下和原位的生长情况,并切取肿瘤组织,应用病理组织学方法对裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤进行检测和评价。结果:人卵巢癌细胞系SKOV3-luc裸鼠皮下和原位移植瘤模型建立的成功率均较高。裸鼠皮下和左侧卵巢接种肿瘤细胞后,可通过活体成像实时观察肿瘤的生长情况,并且行定量分析肿瘤形成时间等。皮下移植瘤(皮下组)成瘤率为100%,左侧卵巢原位移植瘤(原位组)成功率为100%。注射后第7天,皮下组的肿瘤总荧光强度比值为(3.38±2.50)(Fold),原位组为(1.43±1.32)(Fold);第14天,皮下组为(15.73±11.70)(Fold),原位组为(6.44±7.26)(Fold),皮下组第7天和第14天的肿瘤总荧光强度比值均大于原位组(P<0.05)。结论:人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和卵巢原位移植瘤建模成功率高,并能很好地反应肿瘤的生物学行为,实时荧光成像便于观察肿瘤体内生长情况,为研究卵巢癌发展和转移提供了可靠的观察模型。     

Treg细胞/Th17细胞比例失衡在卵巢癌的生长以及微血管、淋巴管生成中的作用

目的:探讨Treg细胞/Th17细胞比例失衡对移植瘤生长及微血管和淋巴管生成的影响。方法:构建卵巢癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型,用磁珠分选人外周血CD3+淋巴细胞,加曲古抑菌素A(TSA)刺激使其Treg/Th17细胞比例失衡,采用流式细胞仪检测Treg/Th17细胞比例。分别将Treg/Th17细胞比例较高和较低的淋巴细胞与人卵巢癌细胞系SKOV3按1∶20比例注射入裸鼠皮下和卵巢包膜下,分别于注射后28天和35天处死称重,观察其对移植瘤生长的影响;免疫组化CD31和LYVE-1染色检测微血管(MVD)和淋巴管(LVD)的表达。结果:Treg高组能促进皮下和原位卵巢癌的生长。皮下模型:注射后第21和28天,Treg高组的肿瘤总荧光强度值均大于Th17高组和对照组;Treg高组的肿瘤重量为(0.60±0.07)g,Th17高组(0.35±0.24)g,对照组(0.25±0.22)g,Treg高组肿瘤重量较Th17高组和对照组重。原位模型:注射后第28天Treg高组肿瘤总荧光强度值均大于其他两组;Treg高组(0.34±0.20)g,Th17高组(0.06±0.03)g,对照组(0.17±0.05)g,Treg高组肿瘤重量比Th17高组重。Treg高组的MVD和LVD表达高于Th17高组和对照组(P0.05)。结论:Treg细胞/Th17细胞比例失衡在卵巢癌裸鼠移植瘤生长中起着重要作用,且Treg高组能影响卵巢癌的生长、微血管和淋巴管的形成。     

MicroRNA-16逆转上皮性卵巢癌耐药的动物实验研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤耐药性的逆转作用,并初步探讨其逆转作用机制。方法:24只BALB/c裸鼠,随机分为四组,每组6只:Ⅰ组给予皮下接种卵巢癌SKOV3细胞株,成瘤后应用顺铂治疗;Ⅱ组皮下接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂治疗;Ⅲ组皮下接种卵巢癌SK-OV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16阴性对照试剂(miR-16 Negative)协同治疗;Ⅳ组接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16化学修饰模拟物(miR-16 Agomir)协同治疗。观察比较四组皮下肿瘤生长情况,种瘤后第35天处死裸鼠,称取肿瘤组织质量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达,免疫组化方法检测各组肿瘤组织中bcl-2蛋白表达。结果:顺铂与miR-16 Agomir协同治疗组裸鼠皮下肿瘤生长受到明显抑制,其肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达水平较其余各组降低,差异具有显著性(P<0.05),其bcl-2蛋白表达亦明显低于其余各组(P<0.05)。结论:miRNA-16可能通过对其靶基因bcl-2的反向调控作用,逆转裸鼠卵巢癌皮下移植瘤顺铂耐药性。     

酞胺哌啶酮对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长及血管生成的作用

目的 :观察酞胺哌啶酮对人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤生长及血管生成的抑制作用。方法 :于裸鼠背部右侧皮下接种SKOV3 瘤源 ,随机分为 4组 :治疗组 - 1和对照组 - 1,皮下移植后次日开始分别给予酞胺哌啶酮 2 0 0mg kg .d-1、等体积 0 .5%羧甲基纤维素钠腹腔内注射 ,共 4周。治疗组 - 2和对照组 - 2 ,皮下移植第 15天开始分别给予酞胺哌啶酮 2 0 0mg kg .d-1和等体积 0 .5%羧甲基纤维素钠 ,共 2周。定期检测皮下瘤体积和裸鼠体重。用免疫组化方法检测肿瘤组织微血管内皮细胞的表达情况 ,在光学显微镜高倍视野下 (2 0 0× )分别计数肿瘤组织的微血管密度 (MVD)。结果 :治疗组裸鼠皮下瘤体积较对照组明显减小 :治疗结束时 ,治疗组 - 1抑瘤率为 4 0 .2 % (P <0 .0 1) ;治疗组 - 2抑瘤率为 2 8.5% (P <0 .0 5)。治疗组裸鼠体重与对照组无明显差异 (P >0 .0 5)。两治疗组皮下瘤的MVD明显降低 ,治疗组 - 1的抑制率为 4 3.7% (P <0 .0 1) ,治疗组 - 2的抑制率为4 2 .1% (P <0 .0 5)。结论 :酞胺哌啶酮能抑制人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤生长及微血管生成 ,其生长抑制作用以早期应用效果显著 ,且其副作用不明显     

抑制VEGF-B表达对人绒毛膜癌裸鼠移植瘤影响的研究

目的:研究RNA干扰下调血管内皮生长因子-B(VEGF-B)表达对人绒毛膜癌裸鼠移植瘤生长、侵袭转移及血管生成的影响。方法:将构建的含VEGF-B shRNA的质粒转染人绒毛膜癌细胞JEG-3,建立裸鼠皮下移植瘤模型。观察shRNA干扰VEGF-B表达对JEG-3裸鼠移植瘤生长及侵袭转移能力的影响,并采用免疫组化技术检测移植瘤组织中VEGF-B的表达变化及其所含CD34标记的肿瘤微血管密度(MVD)的差异。结果:(1)抑制VEGF-B表达可减小裸鼠皮下肿瘤大小(P0.05),并降低肿瘤细胞肺转移的发生率(P0.05);(2)免疫组化结果提示,VEGF-B shRNA转染组移植瘤中VEGF-B表达及MVD均低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);(3)相关性分析显示,VEGF-B蛋白表达水平与绒毛膜癌MVD高低成正相关。结论:VEGF-B基因在绒毛膜癌的体内生长、侵袭转移中起重要作用,shRNA下调其表达能抑制绒毛膜癌细胞的体内生长、侵袭转移,可能与其调控瘤组织内的微血管形成有关。     

荷人卵巢上皮癌裸鼠冻融卵巢组织移植的效果评价

目的:获取人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤癌旁正常卵巢组织,经安全筛查并冻融后移植至去势裸鼠体内,探讨移植后效果,为临床应用提供依据。方法:将人卵巢上皮癌OVCAR3细胞种植于裸鼠皮下以获取瘤源,并进行卵巢原位移植,建立卵巢癌原位移植瘤模型,解剖裸鼠获取癌旁正常卵巢组织。癌旁组:取筛选后的癌旁卵巢组织进行玻璃化冷冻,复苏后分别进行皮下及原位移植,各20例;对照组:同龄正常裸鼠卵巢组织,皮下移植及原位移植各20例;去势裸鼠组:20只同龄去势裸鼠;正常卵巢组:20只同龄正常裸鼠。移植12周后,分析各组裸鼠卵巢组织内卵泡形态及激素分泌功能。结果:40只人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤模型中共获取35份活检正常的癌旁卵巢组织,获取率87.5%(35/40)。玻璃化冷冻前后卵巢组织中卵泡形态及各级卵泡比例均无显著差异(P>0.05),癌旁冷冻组织和癌旁新鲜组织的异常卵泡比例差异无统计学意义(P>0.05),冷冻组织以初级卵泡及次级卵泡等窦前卵泡为主。癌旁组皮下移植组织存活率80%(16/20),对照组皮下移植组织存活率90%(18/20),癌旁组原位移植组织存活率90%(18/20),对照组原位移植组织存活率95%(19/20)。移植后组织内卵泡以次级卵泡及窦状卵泡为主,各级卵泡的形态及构成比和未移植的同龄正常裸鼠卵巢相似(P>0.05);癌旁组卵泡数明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植组织内的各级卵泡数差异无统计学意义(P>0.05)。癌旁组卵泡刺激素水平明显低于去势裸鼠组,而雌二醇水平明显高于去势裸鼠组(P<0.01);癌旁组卵泡刺激素水平明显高于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01),而雌二醇水平明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植的卵泡刺激素水平和雌二醇水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:癌旁卵巢组织冻融移植后有正常卵泡发育及激素分泌功能;皮下移植和原位移植均可取得较好的效果;癌旁卵巢组织冻融移植有望作为卵巢上皮癌患者治疗后恢复卵巢内分泌功能的有效手段。     

沙立度胺对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤血管生成的影响

目的　探讨沙立度胺(Thd;商品名:反应停)对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长及血管生成的影响。方法　建立 15只人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成 3组: (1)Thd组:腹腔内注射Thd(200mg·kg-1·d-1,浓度为 62 5mg/L); (2 )Thd+环磷酰胺 (CTX)组:按上述Thd剂量,加入浓度为 100mg/L的CTX(100mg·kg-1·d-1 ),腹腔内注射; (3)生理盐水组:腹腔内注射 0 2ml生理盐水。观察各组裸鼠皮下移植瘤生长情况、裸鼠体重的变化,并采用RT PCR、酶联免疫吸附法、及Picture二步免疫组化法检测各组瘤组织中血管内皮生长因子 (VEGF)mRNA、外周血中VEGF含量及瘤组织中微血管密度(MVD)。结果　 ( 1 )Thd组、Thd+CTX组皮下移植瘤体积明显小于生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)Thd组瘤组织中VEGFmRNA为 55±9,血中VEGF含量为(29±10)pg/ml;Thd+CTX组瘤组织中VEGFmRNA为 26±7,血中VEGF含量为(12 ±6)pg/ml;生理盐水组瘤组织中VEGFmRNA为 79±7,血中VEGF含量为(71±16)pg/ml。Thd组、Thd+CTX组瘤组织中VEGFmRNA和血中VEGF含量分别与生理盐水组比较,差异均有统计学意义 (P<0.01)。(3)Thd组MVD计数为 (12.6±3.3)条,Thd+CTX组为 (10.6±1.9)条,均明显低于生理盐水组的(19 3±2 8)条(P<0 01)。结论　Thd有抗卵巢癌皮下移植瘤血     

卵巢肿瘤原位移植动物模型的建立

目的:建立能够模拟临床肿瘤发展过程的卵巢癌动物模型。方法:将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株SKOV3(2×106个/只)、A2780多水平细胞数(2×106个/只、5×106个/只、1×107个/只、1.5×107个/只和2×107个/只)裸鼠皮下注射,A2780(1.5×107个/只)腹腔注射。取SKOV3第3代连续传代皮下瘤组织进行裸鼠右侧卵巢包膜下移植。结果:卵巢癌细胞株SKOV3皮下注射、组织块原位移植成瘤率均100%。原位移植卵巢癌裸鼠6～8周时剖腹探查见局部形成较大包块,与周围组织发生粘连,腹腔暗红色血性积液伴脏器广泛性转移,淋巴结转移。卵巢癌A2780细胞株多水平细胞数皮下注射均未成瘤;腹腔注射8周时剖腹探查见腹腔内生成2～3 mL无色澄清腹水,双侧卵巢增大,脾脏明显增大,未能发现任何腹腔瘤块。结论:成功建立了临床转移模式的SKOV3卵巢癌肿瘤细胞原位移植动物模型;卵巢癌A2780细胞接种未能成瘤,可能是因其对宿主体内非特异性免疫反应较敏感。     

RNAi介导的WFDC2基因沉默抑制人卵巢浆液性上皮癌生长的体内实验

目的:利用前期已构建WFDC2基因稳定低表达的人浆液性卵巢癌细胞株SKOV3,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤生长、转移特点的变化。方法:选择前期构建的稳定株进行体内实验。分组:未处理肿瘤细胞组(OEC组)、转染慢病毒空载体组(OEC-mock组)和转染WFDC2小干扰RNA组(OEC-WFDC2-si组)。组织块移植法建立二代卵巢癌荷瘤裸鼠模型。绘制各组的肿瘤生长曲线,实验终点时比较各组肿瘤的体积和重量,免疫组化检测细胞核增殖抗原(PCNA)表达。结果:OEC-WFDC2-si组皮下移植瘤的生长速度显著慢于OEC组和OEC-mock组,差异有统计学意义(P0.05)。OECWFDC2-si组首次出现可见肿瘤的时间晚于OEC组和OEC-mock组,差异有统计学意义(P0.05)。移植后第23天,OEC-WFDC2-si组的肿瘤重量、体积和细胞核增殖抗原(PCNA)表达均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。实验组和对照组均未发现淋巴结转移。结论:WFDC2基因沉默显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞株在裸鼠体内的生长,WFDC2基因可能在人卵巢浆液性上皮癌进展中起重要作用。     

survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3生长的抑制作用

目的观察survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用及其对裸鼠皮下种植瘤成瘤能力的影响。方法构建能在真核细胞中稳定表达survivin反义RNA的载体pcDNA3-SVVas,应用基因重组技术,将pcDNA3-SVVas经脂质体lipofectam ine 2000介导转染卵巢癌细胞株SKOV3(SKOV3/SVVas),同时以空载体pcDNA3转染SKOV3细胞(SKOV3/neo)作为对照;绘制细胞生长曲线,采用免疫组化、RT-PCR和流式细胞仪检测SKOV3/SVVas、SKOV3/neo和SKOV3细胞survivin mRNA及蛋白的表达和细胞凋亡率。将24只裸鼠随机分为3组,每组8只,分别将SKOV3/SVVas、SKOV3/neo、SKOV3细胞接种于裸鼠皮下,观察成瘤情况及肿瘤体积变化。结果与SKOV3细胞比较,SKOV3/SVVas细胞增殖能力明显降低;SKOV3/SVVas细胞survivin蛋白阳性细胞率及survivin mRNA表达量分别为(37.5±1.0)%、0.407±0.022,与SKOV3细胞的(81.2±0.4)%、0.793±0.042和SKOV3/neo细胞的(80.4±0.8)%、0.734±0.039比较,差异均有统计学意义(P<0.01);SKOV3/SVVas细胞凋亡率显著增加,为(27.4±9.6)%,与SKOV3和SKOV3/neo细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3/SVVas组裸鼠成瘤率降低,出现目检可见肿瘤的平均时间延长为(14.0±1.0)d,与SKOV3/neo组的(6.1±0.8)d和SKOV3组的(5.8±0.9)d比较,差异有统计学意义(P<0.01);与SKOV3、SKOV3/neo组比较,SKOV3/SVVas组裸鼠肿瘤生长速度缓慢,肿瘤体积的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论稳定表达的survivin反义RNA能够有效抑制SKOV3细胞生长,降低survivin的表达,诱导SKOV3细胞凋亡;转染survivin反义RNA的SKOV3/SVVas细胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低。     

溶血磷脂酸抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡机制的研究

目的:探讨溶血磷脂酸(LPA)抑制顺铂(DDP)诱导卵巢癌细胞凋亡的机制。方法:体外培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3,选用促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路特异性阻断剂PD98059,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定DDP、DDP+LPA和DDP+LPA+PD98059对SKOV3细胞增殖活性的影响;应用Ho-echst33258荧光染色观察凋亡细胞;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定单用LPA或合用PD98059对SKOV3细胞环氧化酶-2(COX-2)表达的影响;应用流式细胞仪(FCM)测定细胞凋亡及细胞周期的变化。结果:LPA对DPP抑制卵巢癌细胞增殖有拮抗作用,且增加S期细胞比率;联合应用PD98059后,卵巢癌细胞生长受抑制,S期比率降低,而凋亡小体产生增多。RT-PCR结果显示,LPA能促进COX-2表达(P<0.05),而合用PD98059后COX-2表达降低(P<0.05)。结论:LPA通过MAPK信号传导通路抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡,且与COX-2表达有关。     

CO_2对人卵巢癌细胞株生长转移相关因子表达及顺铂敏感性的影响

目的:探讨体外模拟腹腔镜二氧化碳(CO2)气腹环境对人卵巢癌细胞株SKOV3生长转移相关因子表达的影响及CO2气腹环境作用后SKOV3对顺铂(DDP)敏感性的变化。方法:将体外培养的处于对数生长期的SKOV3细胞分为4组,即CO2组、DDP组、CO2+DDP组及对照组。用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)法及免疫细胞化学法检测各组细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白的表达。结果:(1)CO2气体与顺铂间无交互作用(P0.05);(2)CO2处理组肿瘤细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.01);(3)DDP组与对照组、CO2+DDP组与CO2组比较,DDP处理组肿瘤细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.01,P0.01)。结论:CO2环境能促进人卵巢癌细胞株SKOV3生长转移相关因子表达;DDP对肿瘤细胞生长转移因子的表达有抑制作用;CO2环境作用后,肿瘤细胞对DDP敏感性的变化不明显。     

卵巢上皮性癌细胞与腹膜间皮细胞相互作用对卵巢上皮性癌细胞基质金属蛋白酶表达的影响

目的探讨卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞与腹膜间皮细胞(HPMC)相互作用对卵巢癌细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响。方法用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测卵巢癌细胞SKOV3条件培养液(SKOV3-CM)中的转化生长因子β1(TGF-β1)水平。用RT-PCR技术检测SKOV3-CM对HPMC纤维粘连蛋白(Fn)基因的mRNA表达的影响。以无血清培养液、SKOV3-CM、SKOV3-CM+TGF-β1中和抗体、SKOV3-CM+非特异性IgG刺激HPMC,制备成不同的HPMC-CM,并用不同的HPMC-CM、HPMC-CM1+抗Fn抗体及HPMC-CM1+IgG培育SKOV3细胞,以RT-PCR和ELISA分别检测SKOV3细胞MMP-2、MMP-9基因的mRNA及蛋白表达。结果SKOV3-CM中TGF-β1水平为(236±22)ng/L。SKOV3-CM刺激HPMC后,HPMCFn基因的mRNA表达量为2·643±0·051,高于SKOV3-CM刺激前的水平(1·328±0·025),两者比较,差异有统计学意义(P<0·05);SKOV3-CM+TGF-β1中和抗体刺激HPMC后,HPMCFn基因的mRNA表达量为1·897±0·035,低于SKOV3-CM刺激者,两者比较,差异有统计学意义(P<0·01)。用无血清培养液培育的SKOV3细胞检测不到MMP-2基因的mRNA及蛋白表达。HPMC-CM1培育SKOV3细胞后,MMP-2、MMP-9基因的mRNA表达量分别为0·226±0·012、2·66±0·07,蛋白表达量分别为(15·0±0·8)、(37·2±3·5)μg/L,均高于无血清培养液培育者,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0·01)。HPMC-CM1+抗Fn抗体培育SKOV3细胞后,MMP-2、MMP-9基因的mRNA表达量分别为0·138±0·007、1·82±0·06,蛋白表达量分别为(8·8±0·7)、(25·8±2·5)μg/L,均低于HPMC-CM1培育者,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0·01)。HPMC-CM2培育SKOV3细胞后,MMP-2、MMP-9基因的mRNA表达量分别为0·467±0·018、4·28±0·09,蛋白表达量分别为(39·3±3·6)、(62·0±5·3)μg/L,均高于HPMC-CM1培育者,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0·01)。HPMC-CM3培育SKOV3细胞后,MMP-2、MMP-9基因的mRNA表达量分别为0·331±0·015、3·52±0·08,蛋白表达量分别为(27·6±1·9)、(50·0±4·1)μg/L,均低于HPMC-CM2培育者,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0·05),但仍高于HPMC-CM1培育者,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0·05)。结论卵巢癌细胞分泌TGF-β1可活化HPMC,上调HPMCFn表达。HPMC来源的Fn可促进卵巢癌细胞MMP-2及MMP-9基因的mRNA和蛋白表达。     

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。     

慢病毒介导的EZH2靶向RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:通过慢病毒介导的EZH2-shRNA干扰载体,沉默人卵巢癌SKOV3细胞中果蝇zeste基因的人类同源物(EZH2)的表达,探讨靶基因EZH2对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:设计含EZH2基因序列的shRNA慢病毒干扰载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞株;利用CCK-8比色法检测EZH2基因沉默后对SKOV3细胞增殖的影响;利用RT-PCR、Western blot分别检测EZH2、PCNA mRNA及蛋白的表达情况。结果:EZH2-shRNA载体感染SKOV3细胞后,可显著抑制SKOV3细胞生长(P<0.05),并下调EZH2、PCNA mRNA和蛋白的表达(P均<0.05),而在空白对照组和空载体转染组中,无抑制作用。结论:沉默EZH2基因可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,可能是一种新的基因治疗方法。     

小分子细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂flavopiridol联合泰素治疗卵巢癌的实验研究

目的:检测flavopiridol联合泰素对人卵巢癌细胞系SKOV3、裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型的治疗作用。方法:应用CCK-8法、流式细胞术和原位细胞凋亡检测法(TUNEL)检测flavopiridol和泰素作用后卵巢癌细胞系SKOV3的细胞存活率和凋亡率;应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测作用前后细胞中cyclinD1的表达:应用ELISA法检测细胞中活性caspase-3的表达。建立裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型,观测flavopiridol和泰素治疗前后裸鼠肿瘤体积的变化并计算抑瘤率,用TUNEL和免疫组化法分别检测作用前后肿瘤组织中的凋亡情况和微血管密度(MVD)值。结果:flavopiri-dol(300nmol/L)或泰素(1μmol/L)单独应用24h均能显著降低细胞存活率,增强caspase-3活性,诱导细胞凋亡,并下调细胞中cyclinD1的表达。Taxol先作用24h再用flavopiridol作用24h的联合用药对二者的上述作用产生显著的协同效应:联合用药后细胞存活率为(5.2±0.8)%,凋亡率为(51.10±2.52)%,caspase-3活性相对值为0.602±0.008,cy-clinD1相对表达水平为0.264±0.076。Flavopiridol和泰素单独应用均能显著抑制皮下移植瘤生长(抑瘤率分别为84.5%和85.7%),并降低肿瘤组织MVD值(分别为12.4±4.7vs 35.2±10.3和15.2±2.9 vs 35.2±10.3)。二者联合应用抑瘤作用稍差(抑瘤率68.9%),抑制MVD作用(23.0±5.1 vs 35.2±10.3)也不及单药治疗。结论:Flavopiridol和泰素均能通过致凋亡作用显著抑制卵巢癌细胞及移植瘤生长,二者联合应用对体外培养的卵巢癌细胞具有协同杀伤作用,但体内治疗中无协同抑瘤作用。     

血管内皮生长因子与血小板源性生长因子在卵巢上皮性癌淋巴管形成中的作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子(PDGF)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)淋巴管形成中的作用.方法 RT-PCR技术检测淋巴管内皮细胞核标志物Proxl和淋巴管形成相关因子VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D及PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D在卵巢癌细胞株SKOV3、70例卵巢上皮性肿瘤(卵巢良性肿瘤15例、卵巢交界性肿瘤10例、卵巢癌45例)和20例正常卵巢组织中的表达情况.实时定量PCR技术检测卜述90例卵巢组织中Proxl、VEGF-A、-C、-D及PDGF-A、-B、-C、-D的表达水平,并进行相关性分析.结果 (1)Proxl在各种卵巢组织中均有表达,而在SKOV3细胞中无表达;VEGF-A、-C、-D及PDGF-A、-B、-C、-D在SKOV3细胞和各种卵巢组织中均有表达.(2)卵巢癌组织中Proxl(2.2±1.3)、VEGF.A(3.5±1.5)、VEGF-C(19 ±14)、VEGF-D(3.0±1.8)及PDGF-A(3.3±3.3)、PDGF-C(6.9±4.6)的表达水平高于卵巢良性肿瘤和交界性肿瘤(P均＜0.05).(3)Proxl、VEGF-A和PDGF-A在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期(Proxl:2.6±1.3,VEGF-A:4.0± 1.4.PDGF-A:4.1±3.7)、淋巴结转移阳性(Proxl:3.0±1.4,VEGF-A:4.1±1.7,PDGF-A:4.9±4.1)及腹膜转移阳性(Proxl:2.8±0.9,VEGF-A:4.0±1.8,PDGF-A:4.5±4.0)的组织中的表达水平,分别高于Ⅰ～Ⅱ期、淋巴结转移阴性和腹膜转移阴性者(P均＜0.05);VEGF-C、VEGF-D在淋巴结转移阳性卵巢癌组织中的表达水平(VEGF-c:24± 13,VEGF-D:3.9±2.0)高于淋巴结转移阴性者(P均＜0.05).(4)卵巢癌组织中Proxl的表达水平与VEGF-D(r=0.62,P＜0.01)、PDGF-C(r=0.91,P＜0.01)、PDGF-D(r=0.61,P＜0.01)的表达水平呈正相关关系.结论 VEGF-A、VEGF-C和PDGF-A可能通过参与淋巴管形成之外的机制促进卵巢癌的淋巴结转移;VEGF-D可以促进卵巢癌的淋巴管形成及淋巴结转移;PDGF-B与卵巢癌的淋巴管形成及淋巴结转移无关;PDGF-C、PDGF-D参与卵巢癌淋巴管形成,但无促进淋巴结转移的作用.     

子宫内膜癌灶及癌旁组织中LYVE-1、Prox-1表达的临床意义

目的：探讨淋巴管内皮透明质酸受体1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1,LYVE-1）、同源异型盒基因转录因子1（prospero-related homeobox 1,Prox-1）的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系。方法：选取子宫内膜癌石蜡切片标本57例,留取新鲜子宫内膜癌组织及癌旁组织标本共38例。采用免疫组织化学、蛋白质印迹（Western blotting）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Realtime RT-PCR）检测LYVE-1、Prox-1在癌组织及癌旁组织中的表达,分析这2种蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达差异与临床病理特征的关系。结果：①免疫组化显示,组织学分级Ⅰ级患者癌灶内的Prox-1阳性表达率高于Ⅱ级、Ⅲ级患者,差异有统计学意义（P＜0.05）;淋巴脉管间隙浸润（lymph vascular space invasion,LVSI）阳性患者癌旁组织的LYVE-1阳性表达率高于LVSI阴性者,差异有统计学意义（P＜0.05）;LVSI阳性、晚期患者子宫内膜癌旁组织Prox-1表达的阳性率升高,与LVSI阴性及早期患者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。②Realtime RT-PCR及Western blotting检测显示,相对于无淋巴结转移组的癌旁组织,淋巴结转移组癌旁Prox-1蛋白表达量为1.250 0±0.008 2（P＜0.05）,LYVE-1蛋白表达量为1.860 0±0.012 4（P＜0.05）;相对于癌旁组织,淋巴结转移组癌组织中Prox-1 mRNA表达量为0.693±0.083（P＜0.05）,LYVE-1 mRNA表达量为0.42±0.16（P＜0.05）。结论：LYVE-1、Prox-1可能是子宫内膜癌淋巴转移的潜在标志物,子宫内膜癌癌旁组织中淋巴管生成可能与淋巴转移有关。