诱导性多潜能干细胞在血液学的研究进展

诱导性多潜能干细胞(iPScs)是近年来发展十分迅速的干细胞技术,与传统的获得干细胞的方法不同,它通过向体细胞导入几种基冈或者小分子物质直接将其重编程为干细胞,不涉及复杂的技术和伦理问题.已有多种人类体细胞可以重编程为iPSCs,这类细胞具有发育成为三个胚层细胞的潜能,并且可以继续分化为各类细胞.由于拥有这些性质,iPSCs在医学领域中有广阔的应用前景.本文主要讨论iPSCs研究的新进展,及其在输血医学血液病发病机制和治疗等领域中的应用.     

基于诱导多能干细胞技术的罕见病细胞模型及其应用

罕见病的研究受限于样本的可获得性, 对其发病机制了解甚少阻碍了罕见病可行性治疗方法的发现。随着诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技术的建立和日趋成熟, 越来越多的研究开始利用iPSCs技术把患者来源的体细胞转变为iPSCs, 继而再分化为疾病相关的成体细胞。通过对发病过程和功能学分析, 患者特异性iPSCs细胞模型已成为罕见病研究的宝贵工具。iPSCs技术彻底革新了研究者对罕见病发病机制和治疗方法的研究, 尤其是iPSCs技术结合基因编辑和3D类器官方法, 使得iPSCs在各应用领域包括精准医学领域更具强大优势。本文概括介绍iPSCs技术应用于多种罕见病疾病模型建立, 以及在此基础上进行药物筛选和细胞治疗, 以期为罕见病研究者提供新的思路和启示。     

诱导性多潜能干细胞在β地中海贫血中的应用进展

β地中海贫血是一种常见且最早被认识的单基因遗传性疾病,目前有许多治疗该疾病的方法,但这些治疗措施效果有限且成本高;而诱导性多潜能干细胞(iPSCs)是近年来迅速发展起来的干细胞技术.iPSCs技术能将体细胞重编程为干细胞,理论上可以去分化为各类细胞,再将此项技术与基因治疗技术结合起来,对彻底治愈本病有重要意义.笔者主要讨论β地中海贫血的遗传基础及相关机制、iPSCs的发现与在相关领域的应用进展,以及iPSCs用于治疗β地中海贫血中存在的问题及相关改进措施.     

诱导多能干细胞在血液学方面的研究进展

诱导多能干细胞(iPSCs)是通过基因转染技术将某些转录因子导人到动物或人的体细胞中,使体细胞直接重构成为胚胎样干细胞样的多潜能细胞,因其广泛的科研价值及应用前景而迅速成为科学领域的研究热点.近年来,iPSCs在医学再生领域以及自身技术改进方面取得了令人瞩目的成绩,为其应用于临床提供了有力的理论保障.     

诱导性多能干细胞移植治疗帕金森病的研究进展

帕金森病(PD)又名震颤麻痹,是一种多发于中老年人群的神经系统变性疾病[1]。目前研究认为,PD发病机制为脑内黑质纹状体病变,导致多巴胺能神经元(DN)变性死亡,释放的多巴胺(DA)含量降低,从而使患者运动不能。但引起黑质纹状体病变的原因仍不明确。诱导性多能干细胞(iPSCs)是指利用载体将特定的转录因子转染已分化成熟的体细胞,通过重编程技术将其诱导成为具有胚胎干细胞(ESCs)特性的多潜能性干细胞[2]。近年来,iPSCs在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用日益凸显,iPSCs已在体外被成功分化为神经干细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等[3-5],其在临床疾病的治疗中显现出巨大的潜能与应用价值。     

人诱导多能干细胞体外诱导产生红细胞的研究进展

诱导多能干细胞(iPSCs)不仅具有无限增殖的能力,还可以根据不同的需要筛选出特定的表型,iPSCs可定向诱导生成RBC,作为RBC输血的一个新来源。要将此技术应用到临床输血上,还需对一些关键程序进行优化,如用于生成iPSCs的细胞类型的选择、改进用于保障临床应用安全的重编程方法、红细胞分化过程的优化等。     

人参皂苷Rg1参与诱导小鼠多潜能干细胞的研究

目的:观察人参皂苷Rg1对鼠胚成纤维细胞(MEF)向诱导多潜能干细胞(iPSCs)诱导转化效率的影响。方法:采用经典四因子的逆转录病毒载体感染,在细胞感染后3 d内在MEF培养基里加入人参皂苷Rg1(0、0.3、1、3、10μg/mL),进行iPSCs诱导及鉴定。结果:人参皂苷Rg1(1μg/mL)组可明显提高iPSCs的诱导效率,诱导效率为(0.0450±0.0019)%,人参皂苷Rg1(0μg/mL)组为(0.0100±0.0033)%,所获iPSCs经鉴定为阳性。结论:人参皂苷Rg1可能在提高小鼠iPSCs的诱导效率方面发挥一定作用。     

构建脆性X染色体综合征患者来源的诱导多能干细胞系

目的构建脆性X综合征(FXS)患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)。方法采集2个FXS家系患者外周血并分离外周血单个核细胞(PBMC),用含4个重编程转录因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC,获得患者来源的iPSCs;采用细胞形态学、免疫荧光染色等技术对iPSCs进行多能性鉴定;核型分析验证其基因组完整性;利用PCR扩增结合微流控毛细管电泳技术检测重编程前后CGG重复数。结果成功对2个脆性X家系患者的PBMC细胞进行了重编程。患者来源的iPSCs经过多能性验证试验证实,其表达多能性标志基因并具有向三胚层分化潜能;核型分析结果证实iPSCs核型正常;2例先证者细胞系重编程前后的CGG重复数差异无统计学意义。结论通过非整合重编程技术成功构建2个FXS患者来源iPSCs细胞系,为进一步研究FXS疾病提供多能干细胞资源。     

诱导性多能干细胞技术的研究进展及其应用前景

在分化的体细胞中表达转录因子可以诱导体细胞重编程,获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）.这些细胞具有不断的自我更新能力和多向分化潜能,这些细胞重编程领域的突破性研究进展,为细胞重编程机制、人类疾病发病机制的研究及发展新的治疗方法提供了一种强有力的工具.iPS细胞技术是当前干细胞研究领域的热点之一,近年来取得了迅猛的发展.最初,研究者利用逆转录病毒作为载体将4种转录因子导入小鼠成纤维细胞诱导其重编程.近年来,iPS细胞的诱导方法不断改进,包括使用不整合入宿主细胞基因组的病毒载体、非病毒载体或者用基因敲除的方法切除导入的外源基因,从而产生了更为安全的iPS细胞系,许多小分子化合物也被证实能显著提高重编程效率.iPS细胞在再生医学、疾病模型的建立及药物筛选等领域正逐渐显现出它巨大的应用价值.本文回顾过去几年iPS细胞技术的研究进展,包括诱导方法的改进、iPS细胞诱导效率的提高和安全性的提高,并探讨iPS细胞的临床应用前景及当前研究存在的问题.     

胰腺干细胞移植治疗糖尿病

目的分析胰腺干细胞移植治疗糖尿病的相关影响因素、胰腺干细胞的分化途径及其标记物。方法运用文献调查分析的方法,对胰腺干细胞及胰腺干细胞移植治疗糖尿病的研究现状进行回顾性分析。结果胰腺干细胞移植治疗糖尿病在近年取得了突破性进展,但供体的缺乏和移植排斥反应制约着胰腺干细胞移植的广泛应用。胰腺干细胞可能来源于神经前体细胞,胰腺前体细胞的特异性标记物对胰腺前体细胞的提取将有很大的帮助,胰腺干细胞可能由胰腺组织分化而来,也可能来源于其他组织干细胞的横向分化,可应用生物工程、基因工程技术将胰导管干细胞、胚胎干细胞或其他细胞转分化为胰岛素分泌细胞,但将这些细胞诱导成胰腺干细胞,目前仍处于实验室研究的初级阶段。结论随着分子、细胞和发育生物学以及干细胞定向诱导分化技术的研究进展,寻找合适的胰腺干细胞移植物,将为胰腺干细胞移植治疗糖尿病带来新的希望。     

生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化

背景:生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用.目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道.目的:实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据.设计、时间及地点:细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成.材料:纯系清洁级新生24 h内的SD大鼠12只,用于制备软骨前体细胞.生长分化因子5为PeproTech公司产品.方法:免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞.取第3代细胞,分别用含0,10,50和100 μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14 d.对照组采用低糖DMEM培养基.主要观察指标:光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达.结果:分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形. 软骨前体细胞的增殖在48 h内呈剂量依赖性增高,100 μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P<0.05).诱导14 d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成.在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14 d持续表达.结论:生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化.     

无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的实验条件优化选择

目的：胚胎干细胞能够在体外被定向地诱导分化为胰岛素分泌细胞的影响因素多，诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少、功能低。通过对培养条件进行优化选择，是否可增加胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化的可控性，以便在短时间内得到数量更多、功能更强、可用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞。方法：实验于2004-03／2004-10在解放军第三军医大学基础部生理学教研室完成。①小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的制备：孕13d的胎鼠制备成纤维细胞，37℃培养。当成纤维细胞生长完全融合后，用丝裂酶素处理后备用。②胚胎干细胞的培养及扩增：胚胎干细胞接种于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，培养于含白血病抑制因子和胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle高糖培养基中，37℃培养四五天。③胚胎体向神经前体细胞分化的诱导：扩增培养四五天的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化后，于不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养4d，形成胚胎体。收集胚胎体后接种于无血清的选择性培养基，贴壁培养四五天后，细胞分化为神经前体细胞。④神经前体细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导：神经前体细胞用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养4d，再用葡萄糖刺激，神经前体细胞分化为胰岛素分泌细胞。⑤不同分化阶段的细胞检测：用形态学观察、免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、双硫腙染色等方法。结果：①胚胎干细胞经四五天的培养扩增后，可形成细胞致密、形态饱满、折光度高、边界限清楚的典型胚胎干细胞集落，集落呈碱性磷酸酶染色阳性，饲养层细胞不着色。②胚胎干细胞脱离饲养层后，在不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养四五天，可形成球形的胚胎体。胚胎体在无血清神经前体细胞选择性培养基中贴壁培养四五天后，存活细胞85％以上分化为巢蛋白阳性的神经前体细胞。③改用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养后，多突起的神经前体细胞逐步变圆，成为细小的圆形细胞。圆形细胞逐步聚集成集簇状，经葡萄糖刺激后，这些细胞最终分化为具有胰岛素分泌细胞特征的双硫腙染色阳性细胞。结论：用无血清培养法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，增加了实验因素的可控性，使其中最关键的神经前体细胞的比例达到85％以上，整个诱导过程仅需12～15d，增加了胚胎干细胞用于糖尿病治疗的临床运用可行性。     

无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的实验条件优化选择

目的:胚胎干细胞能够在体外被定向地诱导分化为胰岛素分泌细胞的影响因素多,诱导过程复杂,诱导时间长,所得细胞数量少、功能低。通过对培养条件进行优化选择,是否可增加胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化的可控性,以便在短时间内得到数量更多、功能更强、可用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞。方法:实验于2004-03/2004-10在解放军第三军医大学基础部生理学教研室完成。①小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的制备:孕13d的胎鼠制备成纤维细胞,37℃培养。当成纤维细胞生长完全融合后,用丝裂酶素处理后备用。②胚胎干细胞的培养及扩增:胚胎干细胞接种于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,培养于含白血病抑制因子和胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle高糖培养基中,37℃培养四五天。③胚胎体向神经前体细胞分化的诱导:扩增培养四五天的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化后,于不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养4d,形成胚胎体。收集胚胎体后接种于无血清的选择性培养基,贴壁培养四五天后,细胞分化为神经前体细胞。④神经前体细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导:神经前体细胞用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养4d,再用葡萄糖刺激,神经前体细胞分化为胰岛素分泌细胞。⑤不同分化阶段的细胞检测:用形态学观察、免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、双硫腙染色等方法。结果:①胚胎干细胞经四五天的培养扩增后,可形成细胞致密、形态饱满、折光度高、边界限清楚的典型胚胎干细胞集落,集落呈碱性磷酸酶染色阳性,饲养层细胞不着色。②胚胎干细胞脱离饲养层后,在不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养四五天,可形成球形的胚胎体。胚胎体在无血清神经前体细胞选择性培养基中贴壁培养四五天后,存活细胞85%以上分化为巢蛋白阳性的神经前体细胞。③改用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养后,多突起的神经前体细胞逐步变圆,成为细小的圆形细胞。圆形细胞逐步聚集成集簇状,经葡萄糖刺激后,这些细胞最终分化为具有胰岛素分泌细胞特征的双硫腙染色阳性细胞。结论:用无血清培养法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,增加了实验因素的可控性,使其中最关键的神经前体细胞的比例达到85%以上,整个诱导过程仅需12～15d,增加了胚胎干细胞用于糖尿病治疗的临床运用可行性。     

胰腺干细胞移植治疗糖尿病

目的分析胰腺干细胞移植治疗糖尿病的相关影响因素、胰腺干细胞的分化途径及其标记物。方法运用文献调查分析的方法，对胰腺干细胞及胰腺干细胞移植治疗糖尿病的研究现状进行回顾性分析。结果胰腺干细胞移植治疗糖尿病在近年取得了突破性进展，但供体的缺乏和移植排斥反应制约着胰腺干细胞移植的广泛应用。胰腺干细胞可能来源于神经前体细胞，胰腺前体细胞的特异性标记物对胰腺前体细胞的提取将有很大的帮助，胰腺干细胞可能由胰腺组织分化而来，也可能来源于其他组织干细胞的横向分化，可应用生物工程、基因工程技术将胰导管干细胞、胚胎干细胞或其他细胞转分化为胰岛素分泌细胞，但将这些细胞诱导成胰腺干细胞，目前仍处于实验室研究的初级阶段。结论随着分子、细胞和发育生物学以及干细胞定向诱导分化技术的研究进展，寻找合适的胰腺干细胞移植物，将为胰腺干细胞移植治疗糖尿病带来新的希望。     

神经干细胞在脑外伤中的治疗前景

近年来 ,人们已经证明了发育期和成年哺乳动物的脑中存在着具有未分化性和多潜能性的前体细胞———神经干细胞 ,这些细胞可在体外增殖、克隆和基因操作 ,并可由生长因子诱导分化成某一特定的神经细胞。神经干细胞的这种可塑性特点可用于脑外伤后神经功能缺失的修复与重建的治疗。     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化.目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性.再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组.结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%.NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成.静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因.提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力.     

间充质干细胞免疫学特点及在肾脏疾病中的应用

间充质干细胞的多向分化潜能尤其是可分化为肾脏实质细胞的发现让肾脏移植提到了新的高度-自体肾脏移植.间充质干细胞仅低水平表达人类主要组织相容性Ⅰ类分子,而不表达人类主要组织相容性Ⅱ类分子,故而免疫原性较低.此外,间充质干细胞还可阻断树突状细胞的成熟,降低T细胞的免疫应答,并可通过分泌一些可溶性因子来介导免疫抑制.间充质干细胞上述独特的免疫调节功能使其在人和动物体内可以避免异种移植排斥反应的发生.已有较多报道利用啮齿类动物胚胎移植人的间充质干细胞异生培育出新的肾脏及输尿管,且可从成长后的输尿管收集的液体中检测到尿素氮和肌酐明显高于该动物的血清水平,这说明新的肾脏已经产生尿液,而且自体肾脏免疫原性小,植入后不良反应较少,来源供给方便,从而为自体肾脏移植的发展开辟了广阔空间.     

鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

背景：小鼠和人的体细胞能被一些特殊的因子诱导,逆转为类似胚胎细胞的状态,即诱导性多能干细胞。目的：进一步提高鱼卵提取物诱导体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。方法：以鱼卵提取物诱导BALB/C小鼠脾细胞分化为多能干细胞,分别以普通诱导法（鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.2g/L）与微量刺激法诱导（鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L）。结果与结论：与普通诱导法比较,微量刺激法诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原OCT-3/4,Nanog,SSEA-1。证明微量刺激法可进一步提高体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。     

鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

背景:小鼠和人的体细胞能被一些特殊的因子诱导,逆转为类似胚胎细胞的状态,即诱导性多能干细胞。目的:进一步提高鱼卵提取物诱导体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。方法:以鱼卵提取物诱导BALB/C小鼠脾细胞分化为多能干细胞,分别以普通诱导法(鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.2g/L)与微量刺激法诱导(鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L)。结果与结论:与普通诱导法比较,微量刺激法诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原OCT-3/4,Nanog,SSEA-1。证明微量刺激法可进一步提高体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。     

皮肤源性前体细胞的生物学特性与临床应用

背景:皮肤源性前体细胞是一种神经嵴来源的前体细胞,具有多向分化潜能.目的:对皮肤源性前体细胞的培养分离、生物学特性以及临床应用前景作一综述.方法:应用计算机检索PubMed数据库2001-01/2011-01相关文献,以"skin-derived precursor cells,skin-derived precursors,SKPs"为检索词;共检索到文献137篇,最终纳入符合标准的文献36篇.结果与结论:皮肤源性前体细胞具有来源丰富、易于获取和多向分化的潜能等优点,能够分化为在体内外都有功能的Schwann细胞、骨样细胞和胰岛素样细胞等多种细胞类型.其在多种组织修复和疾病治疗,特别是神经损伤再修复中显示了良好的应用前景.但其研究仍存在一些问题,需要进一步深入研究.