组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

利用siRNA干扰MGMT基因表达的初步研究

目的采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,通过构建人O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene, MGMT)基因的特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对人MGMT(hMGMT)基因的沉默作用.方法将合成的发卡样特异性hMGMT RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体并转染体外HelaS3细胞株,以半定量RT-PCR法检测hMGMT mRNA的表达水平,以MTT法检测转染后HelaS3细胞对BCNU的敏感性变化.结果成功构建MGMT siRNA的真核表达载体;所构建的载体能够特异性降低hMGMT mRNA的表达水平,转染后HelaS3细胞对BCNU的敏感性增加.结论该RNA干扰真核表达载体可以特异性干扰hMGMT基因的表达.     

Rab25基因siRNA表达载体的构建鉴定及在人卵巢癌细胞A2780中的表达

目的为研究Rab25基因的功能及卵巢癌的基因治疗,构建针对Rab25基因的siRNA表达载体,转染细胞A2780后观察其对Rab25基因表达的抑制作用,为探索卵巢癌基因治疗的新途径打好基础。方法根据基因库上的Rab25mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSUPER质粒中,并对重组质粒(命名为pSUPER/Rab25siRNA)进行酶切及序列鉴定,后转染卵巢癌细胞A2780,RT-PCR检测转染前后Rab25的表达情况。结果双酶切证实Rab25siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。RT-PCR检测显示转染卵巢癌细胞A2780后有效抑制了Rab25基因的表达。结论成功构建Rab25siRNA表达载体,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建稳定的转染人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)基因的RNAi载体.方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,对ppGalNAc-T2基因mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),PCR方法扩增得到siRNA内源表达系统,转染至人胃癌细胞株SGC7901,运用RT-PCR方法检测筛选得到其中能高效引起ppGalNAc-T2基因表达沉默的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA Oligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;构建ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体,酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞并经G418筛选得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,RT-PCR方法检测该转染细胞株ppGalNAc-T2表达水平.结果:采用RNAi技术,将高表达ppGalNAc-T2的SGC7901细胞的T2表达水平明显降低.结论:成功构建稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,为今后进一步深入研究ppGalNAc-T2的生物学功能奠定了基础.     

针对DEK原癌基因的siRNA真核表达载体的构建

目的 以DEK基因为靶基因,针对其特定核苷酸序列,构建psiRNA-hHDEK表达载体,转染宫颈癌CaSki细胞,观察DEK siRNA对DEK基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的靶向沉默效应.方法 根据DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiR-NA-hHlneo中,构建能在真核细胞中表达的靶向DEK基因的siRNA重组质粒;应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测转染后DEK mRNA和蛋白表达.结果 筛选出阳性克隆,抽提质粒,经限制性内切酶AseI酶切鉴定及测序分析证实合成的siRNA序列正确,并已准确克隆入psiRNA-hHl neo我体中.DEK特异性siRNA栽体构建成功.经RT-PCK和Western Blot测定分析,转染质粒psiRNA-hHDEK CaSki细胞组DEK mRNA和蛋白的表达明显减少.结论 成功构建了DEK特异性siRNA表达载体.设计构建的真核表达载体可以特异性干扰DEK原癌基因的表达,为进一步研究DEK基因的功能奠定了基础.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

靶向人RIP RNAi真核表达载体构建及在人肝癌细胞Huh7细胞中的表达

目的:构建靶向人RIP的小分子干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPERpuro-RIP),在Huh7细胞系中瞬时表达后,检测其对RIP的沉默效果。方法:设计4对含RIP mRNA特异性序列的60 nt DNA链,通过基因克隆技术将其插入真核表达载体pSUPER-puro,构建重组pSUPERpuro-RIP siRNA载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证其正确性。再瞬时转染Huh7细胞,Western blot检测RIP蛋白表达。结果:酶切测序证实载体构建成功,无碱基突变。Western blot结果表明pSUPERpuro-RIP siRNA在Huh7细胞系中有较好的沉默效果。结论:成功构建了靶向人RIP基因的siRNA载体pSUPERpuro-RIP siRNA。     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

大鼠谷氨酰胺合成酶RNA干扰表达载体的构建及其影响星形胶质细胞黏附的初探

目的:构建并鉴定大鼠谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)RNA干扰表达载体,并检测GS对星形胶质细胞黏附的影响?方法:利用软件根据GS mRNA序列设计特异性siRNA序列,与GS 真核表达载体GS-EGFP以LipofectamineTM 2000试剂联合转染Hela-G细胞,以GFP为指标鉴定其有效性;体外合成该siRNA插入序列,将其定向克隆至真核表达载体pRNAT H1.l/Neo中并转染至大鼠星形胶质细胞中,以免疫细胞化学方法鉴定GS的表达;通过免疫化学法对actin特异性染色分析GS RNA干扰后对星形胶质细胞黏附的影响?结果:GS siRNA能有效抑制GS-EGFP在Hela-G细胞中的表达;DNA测序证实合成并被克隆入真核表达载体pRNAT HI.1/Neo的siRNA插入序列完全正确,GS siRNA表达载体可特异性抑制星形胶质细胞中GS的表达;GS RNA干扰导致细胞黏附力显著降低?结论:成功构建大鼠GS siRNA真核表达载体,初步表明GS影响星形胶质细胞的黏附,为后期研究GS在中枢神经系统损伤后反应性星形胶质细胞中的功能奠定了基础?     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

靶向Livin基因siRNA载体的构建和沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞Livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析Livin mRNA序列,设计并合成2个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞Livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向Livinα和Livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞Livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞Livin基因表达的siRNA载体。     

血管内皮细胞生长因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建特异性的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因siRNA真核细胞表达载体，为探索RNA干扰（RNM）分子靶向治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的作用奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的VEGF基因核苷酸序列，按照Keynolds设计原则，针对VEGF的序列及二级结构选择靶序列，设计双链小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs，shRNA）的DNA序列，并与pRNAi-H1质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体pRNAi-H1VEGF siRNA，经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序进行鉴定。结果构建针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序证实与设计完全一致。结论针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体构建成功。     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

ERp29基因的克隆及其在IEC-6细胞中的表达

目的克隆小鼠ERp29基因并在IEC-6细胞中表达.方法采用RT-PCR方法从小肠上皮细胞克隆该基因的编码区,经T-载体克隆并测序证实后构建真核表达载体,并转染IEC-6细胞,RT-PCR分析外源基因的表达.结果从小肠上皮细胞总RNA中成功地克隆了ERp29基因,序列测定结果表明克隆的序列与数据库中序列完全一致.构建的真核表达载体与预期一致,表达质粒转染细胞后的RT-PCR分析结果表明:外源的质粒得到了有效的表达.结论成功地克隆了ERp29基因,并获得真核表达.     

HER4基因siRNA载体的构建及其沉默作用

目的RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默。为了研究表皮生长因子受体对食管癌细胞的作用,文中构建针对人HER4基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体,转染人食管癌细胞Eca-109,观察其基因沉默效果,探索食管癌基因治疗的新途径。方法根据siRNA设计原则,设计针对HER4基因的两条寡核苷酸链,退火后与载体SUPER．neo＋gfp连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染食管癌细胞Eca-109,用荧光定量PCR和Western blot方法检测HERd蛋白表达情况。结果经酶切鉴定和DNA测序分析后,提示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功。转染食管癌细胞后,用荧光定量PCR和Westernblot法检测HER4基因表达水平显著降低。结论成功地构建了针对人HER4基因的siRNA表达载体,并可有效抑制食管癌细胞Eca-109中该基因的表达。     

RNA干扰her2／neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究

目的:HER2/neu表达对肺癌细胞生物学的影响尚不明了,文中运用RNA干扰技术抑制HER2/neu表达,并观察对肺癌A549 细胞体外增殖的影响.方法:构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体,运用脂质体介导转染A549 细胞并用G418筛选出阳性克隆株;半定量RT-PCR和Western检测转染后HER2/neu mRNA及蛋白的表达水平;FCM检测细胞周期分布; MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增值能力.结果:成功构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体(命名为psilence 3.1-HER2),转染后使A549 细胞HER2/neu mRNA和蛋白的表达较未转染组和阴性对照质粒转染组均显著下调;细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢.结论:psilence 3.1-HER2能够稳定、高效、特异地抑制肺癌A549内her2/neu基因的表达,可显著抑制细胞增殖.针对her2/neu基因的RNAi策略有望成为肺癌的基因治疗的新选择.     

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。     

容量调控氯通道基因siRNA表达载体的构建及其沉寂效应检测

目的:构建针对容量调控氯通道基因(CLC3)的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对CLC3基因的干扰作用. 方法:设计CLC3靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER载体,转化扩增后进行序列测定. 用脂质体转染法转染胃癌细胞SGC7901,通过RT-PCR、间接免疫荧光检测CLC3基因表达水平的变化. 结果:把针对CLC3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确,稳定转染人胃癌细胞SGC7901后, RT-PCR、间接免疫荧光检测表明,CLC3基因的表达水平明显降低. 结论:构建了针对CLC3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CLC3基因表达.     

COL1A1-shRNA表达载体的构建及对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响.方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM 4.1- CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株.通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化.结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体.实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05).结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移.