酸性成纤维细胞生长因子与胚胎干细胞的造血分化

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,酸性成纤维细胞生长因子可强烈表达。目的：探讨酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎干细胞造血分化的作用,在拟胚体培养阶段施加酸性成纤维细胞生长因子,验证酸性成纤维细胞生长因子对造血形成细胞产生的调控作用。方法：培养小鼠胚胎干细胞,将饲养层上生长状态良好的小鼠胚胎干细胞用胰酶消化成单个细胞后,利用悬滴法制备拟胚体,拟胚体继续悬浮培养,以1,2和50g／L酸性成纤维细胞生长因子分别培养3,5,7,9d,通过免疫荧光法检测胚胎干细胞与拟胚体中酸性成纤维细胞生长因子的表达,流式细胞术检测FIk-1^＋与CD133^＋阳性细胞率。结果与结论：酸性成纤维细胞生长因子在拟胚体中呈阳性表达。在5μg／L酸性成纤维细胞生长因子作用下,FIk-1^＋细胞随时间增加表达增加,CD133^＋细胞表达模式与FIk-1^＋细胞类似。在1μg／L时,FIk-1^＋细胞在7d时表达达到高峰,随后下降。CD133^＋细胞表达结果类似。而在2pg／L时,5d时FIk-1^＋细胞表达升高,随后下降,在9d时表达又增高。而CD133^＋细胞则总体呈现升高趋势。酸性成纤维细胞生长因子可促进FIk-1^＋与CD133^＋细胞的产生,证明酸性成纤维细胞生长因子能够有效促进拟胚体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少.成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子.目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响.方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代.从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况.收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内.对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况.结果与结论:在含160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10 d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤.含100 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡.提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性.     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞.目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell 非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL 和EB/AGM+FL+BM共4 组.共培养6 d 后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态.结果与结论:①EB/AGM+FL 组和EB/AGM+FL+BM 组收获细胞涂片均发现原始造血细胞.②拟胚体来源细胞经AGM 区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05).③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高.提示AGM+FL 和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层.     

拮抗TGF-β1可抑制胚胎干细胞来源BL-CFC的产生和分化

胚胎干细胞来源的BL-CFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF-β1对BL-CFC产生和分化的调控作用,在拟胚体培养阶段施加TGF-β1和TGF-β1中和抗体,观察不同阶段TGF-β1对BL-CFC的数目及其定向内皮和造血细胞分化能力的影响。结果表明：在拟胚体培养阶段拮抗TGF-β1的作用可显著降低BL-CFC的数量（P〈0.01）;与之吻合的,中和TGF-β1后拟胚体中Flk-1＋细胞比例降低。此外,在拟胚体培养阶段加入TGF-β1可显著增强BL-CFC的造血和内皮细胞分化能力,而中和TGF-β1后分化能力降低。结论：TGF-β1对BL-CFC的产生和分化发挥正向调节作用。     

人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较

背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.     

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道.目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成.材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司.方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7 d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2 mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10~6 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12 μg/L转化生长因子β1组成.②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层.将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养.主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率.结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20 d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY).与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P＜0.05),集落分化率明显升高(P＜0.05).结论:实验初步建立了入胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新.     

小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化

目的:血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品,但来源有限.胚胎干细胞具有发育全能性,目前其定向诱导机制尚不明确.通过选择适当的诱导剂,探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势.方法:实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成.①动物及细胞系:清洁级孕12.5d昆明小白鼠1只,由南昌大学医学院动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018,由American Type Culture Collection提供.②实验方法:取孕12.5 d鼠胚胎,去除头部、内脏及四肢,将组织块剪碎,胰酶消化,分离培养胚胎成纤维细胞,传至3-5代时史换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基,24 h后收集培养液,加入2.0mmol/L L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸,0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1000 U/mL白血病抑制因子,此即为条件培养基.常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ,以1 × 106密度接种,传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞,加入条件培养基5 mL,经过悬滴一悬浮培养,构建拟胚体分化模型.设立3组,各组均置于明胶包被的T25培养瓶中,每瓶加入50个拟胚体,使其均匀分布于培养瓶底.诱导组7～10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3 μ g/L转化生长因子β1,10～21 d加入20μg/L血小板源性生长因子.血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清,全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸.诱导21 d的拟胚体,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞,再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7 d.③实验评估:应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达.通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质.结果:①胚胎干细胞牛长及拟胚体诱导分化:胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体,经过不同生长因子的分阶段联合诱导,拟胚体贴壁后球体略摊开,周围出现大量的梭形细胞.②RT-PCR检测:拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达.③免疫细胞化学检测:荧光显微镜下,罗丹明染色细胞浆呈红色荧光,并可见肌丝结构;DAPI染色细胞核呈蓝色荧光.诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组(P＜0.05).结论:胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后,可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高.随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决,胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞.     

转化生长因子β1联合血管内皮细胞生长因子体外诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化

目的:观察胚胎干细胞在转化生长因子β1和血管内皮细胞生长因子体外诱导分化血管内皮细胞的能力,探讨提高诱导效率的方法。方法:实验于2004/2006在南昌大学医学院第二附属医院血液病研究所进行。实验材料:成年昆明小鼠由南昌大学医学院动物科学部提供(机构许可证号:96021),经自然交配怀孕。小鼠胚胎干细胞129×1/SvJ细胞系,购于ATCC公司。实验方法:取孕12.5～14.5d的胎鼠,制作小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增胚胎干细胞。将饲养层上扩增后生长状态好的胚胎干细胞以0.25%胰酶消化,小心吹打成单个细胞悬液,以差速贴壁法将饲养层细胞去掉,按1×104L-1胚胎干细胞悬液悬滴在细胞培养皿的盖上,每滴10～20μL,不换液,3d后形成拟胚体,培养液为不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液。挑选状态好的拟胚体分3组:转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组、转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组。采用RT-PCR和免疫组织化学方法证实诱导的细胞是否为内皮细胞。结果:①胚胎干细胞体外诱导生长观察:3组中拟胚体贴壁后第2天,胚体均略摊开,周围有上皮样细胞出现,第3,4天有许多卵石样细胞产生,至第6天开始出现由卵石样细胞构成的管状结构,自胚体向周围呈辐射状生长,渐呈网状,诱导时间约2周。转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组中产生的管样结构的拟胚体数较转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组多(44.67±3.88,28.17±6.08,33.00±2.68,P<0.05)。②RT-PCR法检测基因mRNA水平:3组基因表达的扩增片断分别为1086,733,265bp,与DNAmark相比较,条带位置相符。③扩增细胞的免疫组织化学染色:Ⅷ因子抗体反应显示阳性。结论:转化生长因子β1与血管内皮细胞生长因子均能诱导胚胎干细胞为内皮细胞,两者合用有可能提高诱导效率。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

不同发育阶段拟胚体对小鼠胚胎干细胞造血分化的影响

目的 通过对拟胚体(Embryoid body, EB)在造血发育过程中三个不同发育阶段的初步探讨,以了解它们对胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)造血分化的影响.方法 根据不同阶段拟胚体的发育特点,将拟胚体分为三个阶段:EB 3-5天、EB 6-8天以及EB 9-13天.通过形态学、流式细胞仪分析、Realtime PCR以及造血集落形成试验来分析不同阶段拟胚体在造血分化过程的特点.结果 EB培养至第5天、第7天、第10天时,每6000个ES细胞形成EB的数量分别是97、100、88个;流式细胞仪检测CD34+/Sca-1+细胞,结果分别是8.91%、9.23%、12.73%;Realtime PCR结果分别显示EB培养到第6天左右时中胚层发育最为活跃,第10天时造血发育比前两个阶段要活跃;造血集落形成试验显示EB发育至第5天、第7天以及第10天时,每1×105个EB细胞形成的集落数分别是21、26、32.结论 EB 3-5天处于分化早期,各种检测参数数值都相对比较低,适合于次级拟胚体以及爆发集落的培养;EB 6-8天中胚层发育最为活跃;EB 9-13天造血发育相对比较成熟.根据不同阶段拟胚体发育的特点,可以选择适当的拟胚体作为体外造血分化模型来满足不同研究目的 需要.     

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难,因此,探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键.目的观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响. 设计以培养的人胚神经干细胞为观察对象,随机对照实验.单位解放军第一军医大学珠江医院儿科.材料实验于2004-01/05在全军儿科中心实验室进行.随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例(胎儿父母签署同意书),取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养.方法采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养;两种生长因子的浓度均为20 μg/L,采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验;并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测.主要观察指标各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化.结果①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[(150.3±14.9),(173.6±26.4)个/孔,P＞0.05],但均明显多于表皮生长因子组[(99.5±14.9)个/孔,P＜0.01].②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组,而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞.结论①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖,所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元.②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果,提示不存在协同作用.     

中枢神经系统再生的可能性:碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对胚胎神经干细胞生长分化的影响

目的研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎神经干细胞生长和分化的影响.方法从孕11～13d大鼠胚胎神经管取神经干细胞,原代体外培养中加入bFGF和EGF,观察对神经干细胞胞体发育及突起生长的影响.结果EGF主要影响神经干细胞的增殖,也可以促进细胞突起的生长,但胞体直径与相应的对照组无显著差异;bFGF可促进胞体发育及突起的生长;两种因子联合应用,生长作用优于单独应用组.结论EGF和bFGF可以促进原代培养胚胎神经干细胞的生长和分化.     

神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的:神经干细胞的发现为神经系统退行性疾病的治疗,提供了新的方法。通过碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)反应性神经干细胞的移植,探讨神经干细胞在帕金森病(Parkinson'dis-ease,PD)治疗中的作用。方法:体外用bFGF作为丝裂原培养E16大鼠中脑神经干细胞,经BrdU标记后植入PD大鼠纹状体,了解PD大鼠旋转行为的改善情况。结果:神经干细胞移植组PD大鼠旋转行为改善明显。结论:bFGF反应神经干细胞移植对PD有明显的治疗作用。     

Effect of basic fibroblast growth factor in mouse embryonic stem cell culture and osteogenic differentiation

Embryonic stem cells are actively explored as a cell source in tissue engineering and regenerative medicine involving bone repair. Basic fibroblast growth factor (bFGF) has been a valuable growth factor to support the culture of human stem cells as well as their osteogenic differentiation, but the influence of bFGF on mouse embryonic stem (mES) cells is not known. Towards this goal, D3 cells were treated with bFGF during maintenance conditions and during spontaneous and osteogenic differentiation. In feeder‐free monolayers, up to 40 ng/ml of exogenous bFGF did not support self‐renewal of mES without LIF during cell expansion. During spontaneous differentiation in high‐density cultures, bFGF stimulated cell proliferation under certain conditions but did not influence differentiation, as judged by stage‐specific embryonic antigen‐1 expression. The addition of bFGF reduced the alkaline phosphatase (ALP) activity associated with osteoblast activity during differentiation induced by osteogenic supplements, although the extent of mineralization was unaffected by bFGF. The bFGF increased the mesenchymal stem cell marker Sca‐1 in an mES cell population and led to an enhanced increase in osteocalcin and runx2 expression in combination with BMP‐2. These results suggest that bFGF could be utilized to expand the cell population in high‐density cultures in addition to enriching the BMP‐2 responsiveness of mES cells. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

人胎脑皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨人脑皮质中分离培养神经干细胞并鉴定其增殖及分化潜能。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术，从30周自愿水囊引产人胎脑皮质中分离出神经干细胞，并进行培养、传代、分化观察，应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从30周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长，形成神经球，该细胞具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原(Nestin)；在含血清培养时诱导神经干细胞分化，分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用；30周人胎脑皮质仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景:有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。目的:观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。方法:体外分离培养孕12d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1μg/L胶质源性神经营养因子。结果与结论:低氧环境下分化10~12d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件。方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE。结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞。     

bFGF缓释微球对骨髓间充质干细胞增殖作用的实验研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对兔骨髓基质干细胞(BMSC)增殖的长期效应。方法:在细胞培养技术下,不加bFGF或将游离bFGF或bFGF-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球加入第二代兔骨髓间充质干细胞培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)、流式细胞仪观察细胞在第1,2,4,7及10天增殖的状况,并进行统计学分析。结果:培养1d后,三组细胞计数、吸光度(OD)值差异均无显著性意义;2d时,bFGF组的MSCs细胞数高于其余二组,差异有显著性意义(q检验,P<0.05);4d时,各组MSCs细胞依次为:PLGA微球组>bFGF组>空白对照组,各组间差异均有显著性意义(q检验,P<0.05);培养7d、10d时,微球组与上述两组仍有显著性差异。流式细胞仪检测显示,培养2d时,bFGF组的G2/M+S数百分数最高,4d后PLGA微球组G2/M+S数百分数最高。结论:微球通过较长时间持续释放活性bFGF,能长期显著地促进兔骨髓间充质干细胞的增殖。     

纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用(英文)

目的:观察采用ITSF和N2无血清培养方法诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法:小鼠胚胎干细胞的培养和N2无血清条件培养基诱导为神经前体细胞,细菌培养皿法或悬滴法制备胚体,小鼠胚胎干细胞采用NBT/BCIP染色,神经前体细胞的nestin免疫组化染色采用ABC法。结果:细菌培养皿法或悬滴法培养胚体、ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养表面,对胚体的贴壁情况影响不大,但能使无血清培养后存活的神经前体细胞明显增多。结论:小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞,在N2培养基中加入纤维连接蛋白能使存活的神经前体细胞数量增多。