应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的 根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法.方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株.结果 分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增.敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交.应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符.结论 应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值.     

应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株。结果分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交。应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符。结论应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值。     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的多重PCR方法。 方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增,扩增产物分别为473 bp、235 bp和136 bp。应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定。 结果 经多重PCR 扩增后进行凝胶电泳,MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见,NTM标准株仅见136 bp片段。312株MTBC临床分离株中,310株扩增出473 bp和235 bp片段,敏感度为99.36%（310/312）,特异度为99.32%（294/296）;300株NTM临床分离株中,294株扩增出136 bp片段,敏感度为98.00%（294/300）,特异度为100.00%（310/310）。 结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM,具有高度的特异度和敏感度,有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段。     

分枝杆菌临床分离株菌种的分子鉴定

目的 建立对临床分离分枝杆菌菌种快速、精确鉴定的方法学平台,了解分枝杆菌菌种的分布,为结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)病临床精确诊断和有效治疗提供依据.方法 330株分枝杆菌分离株来自于2007年5月至2008年12月在哈尔滨市胸科医院诊断为结核病的住院患者.菌株灭活后提取基因组DNA,采用PCR方法,结合PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA序列测定方法进行菌种精确鉴定.结果 330株临床分离菌株全部精确鉴定,其中328株[占99.4％(328/330)]为结核分枝杆菌复合群(MTBC),2株[占0.6％(2/330)]为NTM.328株MTBC中,MTB 326株、非洲分枝杆菌(M.African)1株、田鼠分枝杆菌(M.microti)1株,分别占MTBC的99.4％ (326/328)、0.3％(1/328)和0.3％(1/328).经测序和基因组同源性分析发现,2株NTM为胞内分枝杆菌(MAC),与MAC的同源性分别为99％和93％,2株菌之间的同源性为93％.结论 建立了临床分离分枝杆菌菌种快速鉴定的方法学平台,临床诊断为结核病的患者MTB比例占绝对优势,也发现有M.African、M.microti和NTM感染.     

应用DNA微阵列技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的 利用DNA微阵列的高通量、高效性,建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法,为临床医师正确诊断提供依据.方法 以DNA直接测序法为对照,通过PCR-SSCP和DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和465株分枝杆菌临床分离株的菌种.结果 应用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性100%.465株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定,256株为结核分枝杆菌复合群,应用DNA微阵列分析,显示与分枝杆菌属探针M和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性,两种鉴定方法结果一致;209株PCR-SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株,经芯片分析,68株为龟分枝杆菌龟亚种和脓肿亚种,46株为胞内分枝杆菌,34株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群,31株为偶然分枝杆菌,16株为戈登分枝杆菌,3株为鸟分枝杆菌,2株为海和溃疡分枝杆菌复合群,1株为土分枝杆菌,1株为迪氏分枝杆菌,1株为草分枝杆菌;另6株只与探针M杂交,经测序显示5株为胞内分枝杆菌,但其基因序列与标准菌株不完全相同,1株为新金色分枝杆菌,芯片上无鉴定该菌种的探针.结论 用DNA微阵列可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,提高分枝杆菌病的正确诊断率,指导临床合理治疗.     

利用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株

目的 建立结核分枝杆菌北京基因型菌株快速鉴定方法 ,研究该家族在人群中的流行传播的规律和特点。 方法 采用间隔区寡核苷酸（spoligotyping）分型与多重PCR方法 分别对临床分离的112株结核分枝杆菌进行北京基因型菌株鉴定。 结果在分析的112株结核分枝杆菌中,107株为北京基因型,多重PCR鉴定结果与Spoligotyping分型符合率为100%。 结论 与spoligotyping分型相比,多重PCR技术可以快速地区分北京基因型与非北京基因型株,且方法 简单,更适于基层试验室中对北京基因型结核分枝杆菌在人群中的流行进行大规模监测。     

靶向高通量测序鉴定非结核分枝杆菌菌种的应用价值

目的:探讨靶向高通量测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)技术在非结核分枝杆菌菌种鉴定的应用价值。方法:收集2021年7月至2022年9月,在广州市胸科医院非结核分枝杆菌病诊疗中心住院患者的428份标本进行研究,其中,痰标本312份,支气管肺泡灌洗液标本116份。对上述标本进行tNGS分枝杆菌鉴定(简称“tNGS法”)和微生物培养(BACTEC MGIT 960)+DNA微阵列芯片法(简称“培养法”)进行分枝杆菌菌种鉴定,并对2种方法检测结果进行比较。结果:(1) tNGS法和培养法分别分离出结核分枝杆菌102份和56份,非结核分枝杆菌150份和182份。(2)tNGS法的分枝杆菌检出率为58.88%(252/428),与培养法阳性率55.61%(238/428)比较,差异无统计学意义(χ²=0.936,P=0.333)。(3)以培养法为参照标准,tNGS法检测分枝杆菌的敏感度、特异度、假阴性率、假阳性率、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为80.65%(200/248)、92.22%(166/180)、2...     

应用DNA微阵列技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的利用DNA微阵列的高通量、高效性,建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法,为临床医师正确诊断提供依据。方法以DNA直接测序法为对照,通过PCR-SSCP和DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和465株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果应用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性100％。465株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定,256株为结核分枝杆菌复合群,应用DNA微阵列分析,显示与分枝杆菌属探针M和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性,两种鉴定方法结果一致;209株PCR-SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株,经芯片分析,68株为龟分枝杆菌龟亚种和脓肿亚种,46株为胞内分枝杆菌,34株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群,31株为偶然分枝杆菌,16株为戈登分枝杆菌,3株为鸟分枝杆菌,2株为海和溃疡分枝杆菌复合群,1株为土分枝杆菌, 1株为迪氏分枝杆菌,1株为草分枝杆菌;另6株只与探针M杂交,经测序显示5株为胞内分枝杆菌,但其基因序列与标准菌株不完全相同,1株为新金色分枝杆菌,芯片上无鉴定该菌种的探针。结论用DNA微阵列可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,提高分枝杆菌病的正确诊断率,指导临床合理治疗。     

传统方法和PCR法在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中的对比研究

目的 对结核分枝杆菌复合群菌种鉴定的传统方法与PCR法进行对比研究,为临床应用提供科学依据。 方法 分别采用传统结核分枝杆菌菌种鉴定方法（对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼）和PCR法,对2010年4月至2011年5月新疆喀什胸科医院住院、临床确诊肺结核患者的313份（例）晨痰标本临床分离株进行菌种鉴定。立意抽样法抽出100份结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非洲分枝杆菌Ⅰ型菌株,用Spoligotyping法检测前两种方法结果的可靠性。 结果 传统方法检测出结核分枝杆菌253株,牛分枝杆菌60株;而PCR法检测出结核分枝杆菌306株,牛分枝杆菌1株,非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,两者间差异无统计学意义(χ²=5.05, P=0.08),两者检测的一致率为79.87%（250/313）。传统方法和PCR法鉴定结果差异虽无统计学意义,但传统方法检测出牛分枝杆菌60株,而PCR法仅检测出牛分枝杆菌1株,差异有统计学意义(χ²=4.16, P=0.04),故用立意抽检100份菌株,用Spoligotyping检测出牛分枝杆菌2株,结核分枝杆菌90株、非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,2株未能检出菌型;其和传统方法与PCR法的一致率分别为38.78%［（2+36）/98］、98.98%［（1+90+6）/98］。 结论 经过Spoligotyping法检测可知,在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中传统方法较PCR法耗时、繁琐,且不能较准确地鉴定出菌种,而PCR法可准确、快速的将其鉴定到亚种。     

应用基因芯片分析结核分枝杆菌常见耐药基因型的研究

目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐药基因型，建立一种新的分子药敏试验方法。方法以传统药敏试验和PCR－直接测序方法为对照，应用基因芯片快速检测157株结核分枝杆菌临床分离株异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药基因（katG、rpoB、rpaL、rrs和embB）的带荧光素标记的PCR产物。结果PCR-直接测序和基因芯片检测36株结核分枝杆菌药物敏感株的5种耐药基因均为野生型。121株结核分枝杆菌耐药分离株中，56株耐INH分离株，katG基因突变率为62．5％，其中katG缺失率为7．5％，315位密码子突变率为55．4％，279位密码子突变率为1．8％；104株耐RFP株，rpoB基因突变率为94．2％，最常见的突变位点为531位和526位密码子（突变率分别为60．6％、15．4％），双位点突变率为5．8％，还发现511、513、515、516、517、518和533位密码子突变；62株耐SM分离株，rpsL和ITS总突变率为88．7％（两者分别为82．3％、6．5％），rpsL突变位于43位和88位密码子（突变率分别为77．4％、4．8％），rrs突变位于513位和516位碱基（突变分别为4．8％、1．6％）；57株为耐EMB株，embB基因突变率为61．4％，均为306位密码子突变，最常见的突变为ATG→GTG或剐rA（突变率分别为35．1％、15．8％），还发现306位密码子ATG→ATC、ATT和CTG突变。通过基因芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论应用基因芯片可分析大多数结核分枝杆菌耐药基因型，弥补传统药敏试验方法的不足，指导临床治疗。     

Amplification of Hsp 65 gene and usage of restriction endonuclease for identification of non tuberculous rapid grower mycobacterium

Background

The rapid grower mycobacteria have emerged as significant group of human pathogen amongst the Runyon group IV organisms that are capable of causing infection in both the healthy and immunocompromised hosts. Study aimed to identification of species amongst rapid grower non tuberculous mycobacterial isolates by polymerase chain reaction – restriction enzyme analysis (PRA). Analysis and comparison of results with standard biochemical tests.

结核分支杆菌与非结核分支杆菌快速鉴别的实验研究

目的 探讨提供一种从菌种水平快速检测和鉴别分支杆菌的方法。方法 应用三对分别对应于分支杆菌(分子量65000)表面抗原、结核分支杆菌插入序列IS6110及人类β-珠蛋白基因的部分序列的特异性寡核苷酸引物对受试菌种及临床标本中的DNA进行多重PCR扩增，其扩增产物分别为439bp、268bp及123bp，并对439bp进行BstE Ⅱ和Hae Ⅲ两种限制性内切酶消化，同时，将135例临床标本进行培养、涂片，和多重PCR联合限制性片段长度多态性分析(mPCR-RFLP)检测。结果 mPCR-RFLP方法可将12种受试的标准菌种分别区分到种及亚种水平。本方法在临床实验中亦体现出较高的灵敏性及特异性。结论 mPCR-RFLP分析是对结核分支杆菌与非结核分支杆菌进行菌种分类鉴定的一种快速有效的方法。     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌DNA

OBJECTIVE: To improve the specificity and sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) technique for detecting and identification of DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis. METHOD: Three pairs of oligonucleotide primer were used in triplex-PCR. A 383 bp DNA fragment encoding part of the 65,000 mycobacterial surface antigen, a 123 bp fragment corresponding to a specific M. tuberculosis complex sequence which was the insertion sequence 6110 (IS 6110) and a 268 bp fragment for human beta-globin were amplified by triplex-PCR respectively. RESULT: The sensitivity of the triplex-PCR-electrophoresis for the DNA of mycobacterium was 0.6 pg. The specific bands of 383 bp and 123 bp among the amplified DNA from M. hominis, M. bovis, BCG and M. simiae were present in the agarose gel. By contrast, only a band of 383 bp was found among the M. nontuberculosis which contained M. avium, M. chelonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. intracellulare and M. smegmatis. Compared with the standard strains, there was an additional 268 bp band in simulated clinical samples infected by Mycobacterium. The above 3 specific bands were found neither in other 15 bacterial species tested nor in Mycoplasma pneumoniae. 182 clinical samples were examined by culture, smear and triplex-PCR. 72 nontuberculous clinical samples were all negative. In 110 tuberculosis clinical samples, the positive rates were 2.7%, 13.6% and 32.7%, respectively. CONCLUSION: The triplex-PCR possesses a high specificity and sensitivity. This method could detect and identify the DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis except M. simiae. It is a valuable tool for early diagnosis and differentiation for infection of M. tuberculosis and M. nontuberculosis.     

分枝杆菌快速鉴定分子技术研究进展

传统的分枝杆菌菌种鉴定方法步骤繁琐,操作费时,已不能满足目前临床诊治的需要.因此,各种分子鉴定方法不断涌现.应用于分枝杆菌的临床实验室诊断.包括DNA测序、多重聚合酶链式反应、聚合酶链式反应一限制性酶切片段长度多态性分析、核酸探针杂交、线性探针分析、基因芯片、焦磷酸测序等多种分析技术,这些技术都可快速鉴定菌种,且具有较高的敏感性和特异性.     

AmpliSensor-聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌及临床应用

目的探讨Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ）在结核病诊断中的价值。方法采用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ对７８４例结核病患者及１６０例肺癌患者的标本进行检测，并与ＰＣＲ（凝胶电泳后，经溴化乙锭染色）、涂片、培养等法比较。结果ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ的敏感性显著高于涂片及培养（Ｐ＜０．０１）。特异性较ＰＣＲ法高。结论ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ可以通过标准曲线划定检出下限，并可换算出标本中原始的靶ＤＮＡ值，同时具有较高的特异性和敏感性，对肺结核尤其是肺外结核的诊断有一定的临床意义。     

应用多重聚合酶链反应技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的 建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(BCG)菌株的方法。方法 依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1，RD1)的基因区，而其他牛分支杆菌菌株和其他结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息，应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否，以鉴别BCG菌株与其他牛分支杆菌菌株及其他MTC菌种。结果 所试5株BCG疫苗生产用标准菌株和近期国内发生的1例小儿BCG接种后全身播散性感染致死病例的2株BCG分离菌株，均缺失RD1基因区；其他牛分支杆菌菌株，包括3株牛分支杆菌标准菌株、5株分别从结核病牛或鹿分离的牛分支杆菌菌株，1株从结核病患痰标本分离的牛分支杆菌菌株，以及其他MTC菌种，包括结核分支杆菌H37Rv和H37Ra标准菌株、48株从结核病患痰标本分离的结核分支杆菌菌株、3株非洲分支杆菌标准菌株，均存在RD1区。结论子多重PCR技术用于牛分支杆菌BCG菌株的鉴定简便、快速、特异，适于在临床实验室应用。