hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的 构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性.方法 PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS).双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp.将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性自血病K562细胞).荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性.结果 扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个.重组质粒pEGFP-HP经酶切和测序鉴定与预期结果 一致.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光.流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1.结论 成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体.该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5'上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列,并对其进行测序和序列分析.方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamH I、EcoR I、Hind Ⅲ、Pst I、Sal Ⅰ及Xbal Ⅰ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL.采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5'上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序.结果:从HL里扩出约1 200 bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序.该序列的3'端与已知NR基因cDNA 5'端序列完全一致.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV 等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列.结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA 周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5'上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL。采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5′上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序。结果:从HL里扩出约1200bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序。该序列的3′端与已知NR基因cDNA5′端序列完全一致。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列。结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5′上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

小鼠PP1基因启动子克隆鉴定及潜在甲基化位点分析

目的 PP1分子是一种与学习记忆相关的分子,目前对其表达调控尚未有系统的研究。为了研究小鼠PP1基因启动子区甲基化潜在的位点和转录因子结合位点而克隆小鼠PP1启动子区。方法本实验利用NCBI上小鼠PP15’非翻译区序列设计引物,使用高保真Taq酶,利用PCR方法扩增昆明小鼠PP1启动子0至-320序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对PP1启动子0至-320序列甲基化情况分析。然后再应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。利用CpG岛序列分析软件分析。结果成功克隆得到PP1基因启动区0到-320 bp片段。甲基化测序分析该片段只有一个CpG位点被甲基化。软件分析表明小鼠PP1翻译起始点到-320 bp区域C+G含量高达70.25%,CpG含量为11.75%,含有70个潜在的转录因子结合位点。结论在小鼠PP1基因启动子区0～-320发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠PP1基因表达调控起重要作用。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

小鼠Reelin 基因启动子克隆鉴定及生物信息学分析

目的克隆小鼠Reelin基因启动子区并分析其潜在DNA甲基化位点和转录因子结合位点。方法根据NCBI上小鼠Reelin 5’非翻译区序列设计引物,利用高保真PCR方法克隆昆明小鼠Reelin启动子区序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对Reelin启动子-636 bp至-135bp序列甲基化情况分析。应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。结果成功克隆了小鼠Reelin基因启动子区0至-450片段。甲基化测序分析小鼠Reelin启动子区-636 bp至-135 bp序列没有CpG二核苷酸被甲基化。小鼠Reelin翻译起始点0至-450片段利用CpG岛序列分析软件分析显示,该区域C+G含量高达78.71%,CpG含量为14.44%。该区域有120多个潜在转录因子结合位点。结论在小鼠Reelin基因启动子区0～-450发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠Reelin基因表达调控起重要作用。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶（ HPSE ）基因内具有增强子（ enhancer , enh ）活性的DNA片段。方法：增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5′端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx （ x分别等于1、2、3……10）,每段长1200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40（SV40）增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子（ CMV）转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40 e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MU-enhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

紧密连接蛋白claudin-10基因5′调控区序列的生物信息学分析

目的:研究紧密连接蛋白对claudin-10基因转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural NetworkPromoter Prediction、PROMOTERSCAN和PROMOTER2.0分析claudin-10基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件EMBOSS和CpGIsland Searcher分析claudin-10基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析claudin-10基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:claudin-10基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box和3个GC-box,没有TATA-box;claudin-10基因可能存在4个启动子位点;CpG岛为444bp区间(1700bp-2143bp)或834bp区间(1367bp-2200bp);评分在85分以上时,该区域具有159个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上时,该区域具有48个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上时,该区域具有9个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于claudin-10基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义,但最终的结论还需要实验来证实。     

人UCA1基因转录调控的生物信息学分析与鉴定

目的生物信息学分析与鉴定人类膀胱癌特异性表达的UCA1 基因转录调控作用原理。方法运用CpG岛预测软件
EMBOSS CpGplot、CpG Island Searcher、Methprimer、CpG finder对UCA1基因启动子CpG岛进行分析。利用转录因子预测软
件MatrixCatch和TFSEARCH对UCA1基因核心启动子区可能结合的转录因子进行分析。染色质免疫沉淀技术对所预测到的
转录因子进行分子生物学实验验证。结果CpG岛预测发现UCA1基因全长启动子区中不存在CpG岛,因此UCA1基因属于组
织特异性基因与前期研究报道结果一致。生物信息学预测及筛选发现UCA1基因核心启动子存在4个与肿瘤关系密切的转录
因子。根据预测结果选取2个转录因子利用染色质免疫沉淀实验鉴定,确定1个转录因子可与UCA1基因核心启动子区结合。
结论UCA1 基因启动子区无CpG岛存在,该基因核心启动子区可能与多种转录因子结合,并确定转录因子c-Myb 可以与
UCA1基因核心启动子区结合。
     

人端粒酶逆转录酶核心启动子的克隆

目的克隆出人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子,为构建hTERT核心启动子调控的重组腺病毒提供实验基础。方法提取肝癌细胞HepG2基因组DNA作为模板,进行PCR扩增,扩增产物酶切后亚克隆至pcDNA3.1（＋）质粒。对重组体进行酶切和测序鉴定。结果PCR扩增出约250 bp的目的片段,经酶切和测序鉴定表明质粒构建成功。结论hTERT核心启动子的成功克隆,为进一步实验提供了基础。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.