内皮型一氧化氮合酶基因转染人体外培养大隐静脉的实验研究

目的　探讨腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合酶基因转染人大隐静脉 ,进行体外培养后检测人内皮型一氧化氮合酶基因的表达 ,并对内膜增生进行研究。方法　取 6例冠状动脉旁路移植手术患者剩余大隐静脉 ,横切成 5mm血管环 ,随机分为 3组 ,每组 6份 ,A :对照组 ,B :空载腺病毒液感染组 ,C :eNOS基因转染组。B ,C组分别置于空载腺病毒液和AdCMVeNOS溶液中 1h ,取出后体外培养 14d ,应用多聚寡核苷酸探针和高敏感标记技术及使用敏感加强型的原位检测方法检测外源性基因mRNA的表达 ;免疫组织化学染色方法检测eNOS蛋白的定位 ;HE及弹力纤维染色后 ,应用计算机图像分析系统检测移植静脉内膜、中膜增生情况。结果　培养的大隐静脉在 14d后有新内膜形成和显著的中膜增厚 ,人内皮型一氧化氮合酶基因在人体外培养大隐静脉中表达出相应的mRNA和蛋白质 ;培养 14d ,与对照组相比 ,空载腺病毒液感染组大隐静脉内膜和中膜厚度无明显变化 ;eNOS基因转染组移植静脉内膜和中膜厚度分别减少 33. 6 %、11. 6 % ,内膜厚度 /中膜厚度比值 (I/M)减少 5 3. 8%。结论　腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合酶基因成功转染体外培养大隐静脉中并有效表达 ,eNOS基因具有防治体外培养大隐静脉内膜增生作用。     

联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法：制作20只自体颈静脉腹主动脉移植Wistar大鼠模型，实验组、对照组各10只，实验组移植血管行腺病毒介导的eNOS溶液泡和反义ET核酸凝胶涂布，对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。要后2周取出植物血管，利用病理学、免疫组织化学、RT－PCR方法检测移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、内膜VSMC数及PCNA阳性表达、血管ETmRNA、eNOS、mRNA表达情况。结果：实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减小或减少，PCNA阳性表达及ETmRNA表达较对照组减少，而eNOSmRNA表达则明显增加。结论：联合传染eNOS基因和反义ET核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生，是一种有效的防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

局部应用VEGF-165抑制兔颈移植静脉内膜增生的研究

目的 探讨局部应用VEGF-165抑制兔颈移植静脉内膜增生的机制。方法 健康家兔24只,均建立颈外静脉-颈总动脉移植模型并分为对照组及实验组。对照组移植静脉周围仅应用Pluronic-F-127,实验组移植静脉周围应用Pluronic-F-127+VEGF-165。观察静脉移植血管外膜、内膜增生情况,移植静脉VEGF及eNOS的表达量,增殖细胞核抗原PCNA表达情况。分析外膜厚度与静脉桥血管内膜增生的关系。结果 与对照组相比,实验组移植静脉内膜增厚明显减轻、而外膜明显增厚,移植静脉eNOS的表达量明显增加;实验组移植静脉平滑肌细胞向外膜方向迁移;术后免疫组化检查显示,实验组移植静脉血管壁内膜VEGF-165的蛋白含量高;两组移植静脉PCNA的表达量未及明显差异。结论 VEGF-165可以通过增加内皮eNOS表达加速移植静脉血管内皮化,促进移植静脉外膜生长促进平滑肌向外膜迁移减轻移植静脉内膜增厚。     

联合转染p21基因及反义C-Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

①目的　探讨联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响 ,探索一种理想的预防血管再狭窄的基因疗法。②方法　选用 2 0只新西兰家兔 ,实验组 10只 ,对照组 10只 ,均行自体颈静脉、颈总动脉移植手术 ,实验组行腺病毒介导的p2 1cDNA溶液浸泡和反义C Fos寡聚核酸凝胶涂布 ;对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后 2周取出移植血管 ,分别检测移植血管内膜厚度、内膜平滑肌细胞数 (VSMC)及内膜平滑肌细胞增殖细胞抗原 (PCNA)阳性表达情况。③结果　实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、VSMC数及PCNA阳性表达情况较对照组均有明显差异 (t=2 8.30～ 38.5 2 ,P <0 .0 1)。④结论　联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生 ,是一种有效防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

eNOS基因转移对山羊移植血管内膜增生的抑制作用

目的探讨eNOS基因转移防治移植静脉血管桥再狭窄的可行性.方法构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMVeNOS)和腺病毒空载体(AdCMV).取山羊颈静脉作血管桥,在体外转染AdCMVeNOS(实验组)和AdCMV(对照组),然后旁路移植到自体颈动脉上.术后30d免疫组化染色,测定静脉桥3H-TDR的掺入量和静脉桥内膜厚度及管腔狭窄面积百分比,观察eNOS基因在静脉桥中的功能表达和静脉桥新生内膜的增生情况.结果转染后30d,实验组静脉桥中外源性eNOS仍有功能表达;静脉桥3H-TDR掺入置与对照组相比明显减少(P＜0.01);静脉桥平均内膜增生厚度和管腔狭窄面积百分比明显低于对照组(P＜0.01).结论eNOs基因转移可以有效抑制移植血管新生内膜的增生,对预防移植血管的狭窄有一定作用.     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

兔颈静脉动脉化后血管的重塑机制

目的: 建立兔颈动脉静脉桥旁路移植模型,观察不同时期静脉桥病理改变及PCNA,α-actin表达和检测细胞凋亡,探讨移植静脉重塑机制. 方法: 家兔30只,将一侧颈总动脉与颈外静脉分别游离后,行颈总动脉与颈外静脉侧侧吻合,结扎颈外静脉两吻合口外侧及颈总动脉吻合口中部,使动脉血经颈外静脉桥通过,于术后不同时间段取静脉桥行HE及弹力纤维染色,定量分析血管壁内膜、中膜厚度,观察PCNA,α-actin表达和细胞凋亡情况. 结果: 30只家兔全部存活,静脉桥全部保持通畅;病理所见静脉桥血管壁增厚、血管内膜及中膜均明显增生,术后2～4 wk内膜增生达高峰,且厚度不均匀,中膜、内膜均有PCNA阳性表达,内膜出现α-actin阳性表达,术后1 wk血管内膜及中膜开始出现凋亡细胞,术后4 wk达高峰. 结论: 兔颈静脉动脉化后静脉血管管壁呈不均一性增厚,早期以血管内膜增生为主,中膜血管平滑肌细胞增殖并向内膜迁移,细胞凋亡可能参与血管桥重塑.     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

自体移植静脉p21, p16, CyclinD1 mRNA基因表达与SMC增殖的关系

目的：探讨P16，P21和CyclinD1 mRNA在自体移植静脉的表达及其与平滑肌细胞(SMC)增殖的关系．方法：以新西兰兔建立自体移植静脉SMC增殖模型，用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色观察SMC增殖水平，用原位杂交观察P16，P21和CyclinD1 mRNA表达水平．结果：P16 mRNA在正常颈静脉无表达，移植后仅少量表达，与内膜SMC增殖无相关性．p21 mRNA在正常颈静脉低水平表达，4-8wk表达明显增加，12wk降低，表达水平在1-8wk与内膜SMC增殖呈负相关(r＝-0．908，P＜0．01)．CyclinD1 mRNA 1-2wk为表达高峰，4wk后逐渐下降，表达水平与内膜SMC增殖呈正相关(r＝0．951，P＜0．01)．结论：p21和CyclinD1 mRNA表达与自体移植静脉内膜SMC增殖有明显相关性，p21可能对自体移植静脉内膜SMC增殖起抑制作用，CyclinD1可能起促进作用．     

体内转染eNOS基因抑制损伤后动脉内膜新生的实验研究

目的 研究体内转染eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因对损伤后血管内膜新生的抑制作用.方法 2F球囊导管损伤大鼠颈总动脉内膜后,随机分成空白对照组、pcDNA3、1(-)组和pcDNA3.1-eNOS组,分别以PBS、脂质体Fugene 6介导pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1-eNOS体内转染至损伤后血管段,2周后对转染后血管平滑肌细胞行RT-PCR鉴定eNOS基因mRNA表达;转染1个月和2个月后对各组颈总动脉行免疫组化染色,计算机图像分析计算新生内膜面积(1)、新生内膜/中膜面积比值(I/M).结果 pcDNA3.1-eNOS体内转染组的颈总动脉血管平滑肌细胞有效表达eNOS基因mRNA.转染后1个月和2个月,eNOS基因体内转染组血管新生内膜面积、I/M比值均比PBS对照组、空载体pcDNA3.1(-)转染组显著减少(0.01).结论 eNOS基因体内转染损伤后动脉能有效抑制血管内膜新生,防止损伤后血管再狭窄.     

纳米粒子介导的BMP-2基因转染对移植血管内膜增生的抑制作用

［摘要］ 目的：研究人骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因局部转染后,BMP-2基因蛋白过表达对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用,探讨防治移植静脉再狭窄的新途径。方法:以包载BMP-2基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米级粒子混合物(BMP-2-PLGA)转染培养的兔VSMC,作为BMP-2-PLGA纳米粒子组,同时设空白PLGA纳米粒子组及对照组,MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。建立自体静脉移植兔模型,随机分成转基因组、空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组,分别于术后3、7、14和28 d取出移植静脉,Verhoeff染色检测血管内膜厚度,Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达,免疫组织化学法检测BMP-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果：与对照组比较,BMP-2-PLGA纳米粒子组细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05),细胞增殖抑制率及细胞凋亡率增加(P<0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔血管内膜平均厚度明显减少(P<0.05),空白载体粒子组与单纯静脉移植对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔移植静脉组织BMP-2蛋白表达于术后3、7和14 d明显增多(P<0.05),PCNA表达于术后7～28 d明显降低（P<0.01）;空白粒子组与单纯静脉移植对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：BMP-2基因的表达能够有效抑制自体静脉移植后内膜增生及VSMC的增殖,促进体外培养VSMC的凋亡。
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Effects and mechanisms of non-restrictive external stent for prevention of vein graft restenosis in a rabbit model

Background Among various treatments preventing vein graft restenosis, external stent is receiving more and more attention. This study aimed to investigate the effect of non-restrictive external stent on the prevention of vein graft restenosis and the potential mechanisms of platelet-derived growth factor （PDGF） in the process of restenosis.Methods Thirty-six ＂New Zealand white rabbits＂ were randomly divided into two groups, stented group （group S） and control group （non-stented group, group NS）. Each rabbit underwent a reversed autologous external jugular vein into common carotid artery bypass grafting. In group S, the vein grafts were surrounded by a non restrictive stent which was 6 mm in diameter （a kind of Dacron vascular prosthesis）; and in group NS, there was no stent to support the vein grafts.The grafts were harvested at the first week （1W）, second week （2W） and fourth week （4W） after surgery respectively. The dimensions （including the thickness and area of the intima and media, luminal area） were measured by computer-aided image analysis system, and the intimal hyperplasia ratio was defined as the percentage of the area enclosed by the internal elastic lamina occupied by the intima.Results At 1W, the difference of the thickness and area of the intima between groups S and NS was not significant （P 〉0.05）; at 2W and 4W, the thickness and area of the intima and the intimal hyperplasia ratio in group S were less significant than those in group NS （P 〈0.05）; from 1W to 4W, the thickness and area of the media in group S were smaller than those in group NS （P〈0.05）. Immunocytochemistry staining of PDGF-B showed that the percentage of positive cells of intima in both two groups was peaked at 2W, and a significantly smaller percentage was detected in group S compared with that in group NS at 2W and 4W （P 〈0.05）; the percentage of PDGF-B positive cells of media in both two groups was also peaked at 2W, and that in group S was smaller than that in group NS from 1W to 4W （P 〈0.05）; and the percentage of PDGF-B positive cells of adventitia in group S was peaked at 4W, whereas the percentage of adventitia in group NS peaked at 2W, and the percentage of adventitia in group S was greater than in group NS at 4W （P 〈0.05）.Conclusions Non-restrictive external stenting inhibits the hyperplasia of the intima and media of the vein grafts and reduces the thickness and area of the intima and media; Non-restrictive external stenting inhibits the synthesis of PDGF and changes its distribution, and then inhibits the hyperplasia of the intima.     

局部缓释雷帕霉素抑制静脉移植血管内膜增生

目的探讨局部缓释雷帕霉素对于静脉移植血管内膜增生的影响,为临床提供实验依据。方法健康家兔24只,均建立颈外静脉-颈总动脉移植模型分为4组,空白对照组,建立静脉移植模型;P luron ic F-127对照组:在移植血管局部喷洒20%缓释载体P luron ic F-127 0.5 m l;低剂量组:在移植血管局部喷洒携带雷帕霉素(50μg/cm2)的20%P luron ic F-127 0.5 m l;高剂量组:在移植血管局部喷洒携带雷帕霉素(100μg/cm2)的20%P luron ic F-127 0.5 m l。观察静脉移植血管内膜增生程度及管腔狭窄程度,增殖细胞核抗原表达及细胞凋亡水平。结果低剂量组和高剂量组较空白对照组和F-127对照组内膜增生减轻(内膜厚度分别为29μm±10μm、16μm±8μm与90μm±11μm、85μm±11μm),管腔再狭窄程度减轻(管腔面积/总面积比分别为0.80±0.36、0.91±0.13与0.58±0.11、0.65±0.47),平滑肌细胞增殖受抑制(细胞增殖指数分别为20%±9%、14%±7%与31%±7%、35%±6%),细胞凋亡水平上升(凋亡指数分别为33%±7%、36%±8%与16%±6%、18%±8%),且上述作用随雷帕霉素剂量增加而增强。结论局部缓释雷帕霉素可以有效抑制静脉移植血管内膜增生,这种作用是通过抑制平滑肌细胞增殖以及促进凋亡而实现的。     

C-myc siRNA抑制大鼠自体移植静脉再狭窄的研究

目的静脉移植术后c-myc基因持续高表达是导致血管内膜增生进而再狭窄的原因之一。文中探讨通过局部给药方法给予针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对自体移植静脉内膜增生的影响。方法建立SD大鼠自体颈外静脉-颈总动脉移植模型。32只大鼠按移植静脉外膜局部给药不同处理方式方法分为未处理组(No treatment组)、凝胶组(Gel组)、无义序列组(scramble sequence group,SCR组)、c-myc RNA干扰组(C-myc siRNA组),于术后3周处死大鼠取移植静脉,光学显微镜下测量内膜厚度,免疫组化染色检测移植静脉增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、c-myc蛋白的表达,Q-RT-PCR检测移植静脉c-myc mRNA的含量。结果 C-myc siRNA组内膜厚度[(15.0±2.2)μm]显著低于No treatment组[(58.3±8.3)μm]、SCR组[(60.5±6.1)μm]和Gel组[(63.5±5.4)μm]。C-myc siRNA组静脉内膜区和中膜区PCNA阳性细胞率显著低于SCR组[分别为(8.4±2.2)%vs(68.5±5.0)%,P<0.05和(15.0±3.1)%vs(55.2±7.5)%,P<0.05],c-myc蛋白阳性细胞率C-myc siRNA组显著低于SCR组[(30.6±2.6)%vs(48.5±3.5)%,P<0.05]。C-myc siRNA组移植静脉中c-myc mRNA的表达相对量显著低于SCR组(0.48±0.05 vs 1.00±0.12,P<0.05)。结论C-myc siRNA能抑制移植静脉中平滑肌细胞的增殖,抑制内膜的增生,减轻移植静脉再狭窄程度。     

反义Smad3转染阻断TGF-β1信号转导对球囊损伤后大鼠血管内膜增生的影响

目的 通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型并体内转染反义Smad3腺病毒载体,研究阻断TGF-β1/Smad3信号途径对损伤后大鼠颈动脉内膜增生的影响.方法 90只SD大鼠随机分为单纯损伤组(单纯球囊损伤大鼠颈动脉内膜)、干预组(损伤后局部保留灌注反义Smad3腺病毒液)、空白对照组(损伤后局部灌注空载腺病毒液);另取6只同周龄大鼠作为正常对照组(不进行任何处理).各组分别在损伤后第1天、3天、1周、2周、1月、3月时处死大鼠并取材.ELISA法检测单纯损伤组和正常对照组不同时间点血清中TGF-β1的质量浓度;Real-time PCR和HE染色法分别检测三个损伤组在不同时间点Smad3 mRNA表达和血管壁内膜、中膜厚度.结果 单纯损伤组各时间点TGF-β1的质量浓度较正常对照组显著升高(P<0.05).干预组第1天、3天、1周、2周、1月时的Smad3 mRNA表达和第1天、2周、3月时的内膜/中膜比值均较单纯损伤组明显下降(P<0.05);单纯损伤组与空白对照组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 体内转染反义Smad3可以阻断TGF-β1/Smad3信号转导,从而抑制内膜增生.     

高脂血症对移植前静脉内皮功能和组织形态的影响

目的:研究静脉移植前高脂血症对静脉内皮功能和组织形态的影响.方法:成年雄性健康家兔50只,随机分为对照组(普通饮食)和实验组(高脂饮食),每组25只;分别在实验前和喂养2周、4周、8周、12周末,采集血样本和获取颈内静脉标本,酶标法检测血脂水平.获取静脉标本前行超声多普勒检查观察其管壁厚度、管腔内径变化以及有无脂质或粥样硬化斑块等.免疫组化法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达,硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)生成量,同时进行病理组织学检查.结果:(1)高脂喂养8周血脂升高异常显著(P＜0.01),并稳定于此较高水平,同时出现颈动脉脂质斑块.(2)高脂血症兔颈内静脉eNOS蛋白表达、NO生成量显著降低(P＜0.05),可见内皮剥脱、弹力纤维明显减少甚至消失,未见泡沫细胞和粥样斑块.结论:高脂血症可导致静脉内皮功能不全和组织形态学异常.     

辛伐他汀联合左旋精氨酸对自体移植静脉保护作用的实验研究

目的研究辛伐他汀联合左旋精氨酸对兔颈外静脉移植至股动脉后的保护作用,并探讨可能的机制。方法50只新西兰大白兔,随机分为辛伐他汀实验组、生理盐水对照组。术前3 d开始采用灌胃法给予辛伐他汀（10 mg/Kg溶于10 ml生理盐水）,经耳缘静脉给予左旋精氨酸（100 mg/kg）,对照组给与等量生理盐水,每天一次,直至术后取材。所有动物于术日建立自体静脉旁路移植模型：利用显微外科技术将颈外静脉端侧吻合于股动脉,于术后4周取血管桥标本,同时取0.5 cm移植静脉作为正常静脉参照。光镜下观察、测定移植静脉内膜中膜厚度变化。扫描电镜观察近吻合口处和中央部静脉桥的管腔狭窄程度（管腔增生面积与管腔面积比（S1/S2）,统计学分析各组间差异。结果移植4周后,各组静脉均有内膜及中膜较正常颈静脉明显增厚表现,辛伐他汀组内膜及中膜增厚较对照组轻。两组静脉桥的管腔狭窄程度进行比较存在明显差异。结论（1）兔颈外静脉移植至股动脉后内膜及中膜增厚。（2）辛伐他汀联合左旋精氨酸能抑制动脉化静脉内膜及中膜增厚,有减轻桥静脉狭窄的作用。