凝胶添加物对人轮状病毒空斑形成的影响

本文将不同剂量的胰蛋白酶、DEAE-葡聚糖、Con A、PHA、氢化考的松、更生霉素、维生素B_(12)和二甲亚砜加入凝胶覆盖物,观察它们对人轮状病毒(HRV)Wa株空斑形成的影响。结果表明,胰蛋白酶是HRV Wa株产斑的重要条件,其较适浓度为3～5μg/ml,DEAE-葡聚糖对HRV Wa株的出斑无促进作用,且产生明显的抑制效应,在所试剂量范围内,Con A、PHA、氢化考的松和更生霉素用作凝胶添加物,对HRV Wa株在MA104细胞上空斑形成也有明显抑制作用,而维生素B_(12)、二甲亚砜则无影响。     

轮状病毒细胞培养的若干研究

轮状病毒(RV)细胞培养问题迄今尚未完全解决。为此,我们从筛选RV 敏感细胞和改变 RV 培养条件入手研究,发现恒河猴胚肾传代细胞 Frhk-4对不同血清型的人和动物 RV 标准株敏感,感染后有明显 CPE。将刀豆素 A(Con A)加入营养液中,在细胞生长过程中预处理细胞时,能显著增加 Wa 株的空斑数目和增殖滴度,加速 CPE 的发展,而用 Con A 预处理病毒、加入病毒接种液或加入凝胶覆盖物时,则明显抑制 Wa 株的空斑形成。此外,我们发现,Wa 株经细胞培养多次传代后,有变异株产生,所分离到的3个克隆株的基因图谱与原始 Wa 株有明显差异。对此,国内外均未见报道。     

轮状病毒培养纯化及重组子代分析

人轮状病毒Wa和Hu7株细胞培养条件中,胰蛋白酶处理和旋转培养,在病毒增殖和细胞病变生成过程中起关键作用。通过对一株人轮状病毒FH4232株与猴轮状病毒SA11株的混合感染株的体外培养和空斑纯化,发现子代克隆中有2株FH4232与SA11株生成的重组子代。重组子代病毒株的第5、11条泳带来自亲代FH42321株,其余多条则来自亲代SA11株。体外轮状病毒重组子代的发现对研究其基因重组变异有重要意义,而且为疫苗制备和应用提供有效途径。     

细胞培养分离人轮状病毒的研究

1980年Wyatt等报道,用含人轮状病毒(HRV)的粪液感染已知菌小猪,经体内传代后,接种于细胞培养获得第一株HRV—Wa株。最近,一些研究者报道,分离到HRV。     

抗人轮状病毒牛血丙球蛋白的研制

目的通过牛源抗人轮状病毒免疫球蛋白的研究,并经胃肠道给药观察其对人丁感染仔猪腹泻的治疗效果。方法以人轮状病毒（HRV“Wa”株）为抗原免疫接种健康育肥黄牛,制备成牛血丙球蛋白口服液。结果丙球蛋白含量达52mg／ml,纯度达80％,中和抗体效达1：16384,初步研究表明对人工感染HRV“Wa”毒株发生腹泻的仔猪治疗有效率达92．3％．．结论牛源抗人轮状病毒免疫球蛋白可能成为新型治疗轮状病毒引起腹泻的有效新药。     

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析

目的 探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法 在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果 用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hochi)、3株动物RV(EW、OSU、SAll)和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(wa、KUN、AU-1、Hochi)和3株动物RV(EW、OSU、SAll)同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右; (2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.     

Wa株轮状病毒感染昆明小鼠乳鼠腹泻模型的建立及影响因素考察

目的：建立人源性Wa株轮状病毒感染昆明小鼠乳鼠腹泻动物模型。方法：采用不同接种方式（口服、注射）、不同滴度、不同剂量的Wa株轮状病毒感染4 d龄昆明小鼠乳鼠,观察昆明小鼠乳鼠的体征反应、腹泻率和腹泻程度;选择腹泻率和腹泻程度较高的条件进行模型的稳定性考察,观察体征反应、腹泻率、腹泻程度、小肠形态学等指标改变。结果：采用强饲法,Wa株轮状病毒滴度为10-3.3/25μL TCID50,被轮状病毒攻击24 h后出现腹泻表现,低剂量（50μL/只）病毒组及中剂量（100μL/只）病毒组腹泻率及腹泻程度较低,高剂量（200μL/只）病毒组感染后第1天（1 dpi）腹泻率可达80%,腹泻程度达3.0,连续4 d保持腹泻状态,在各剂量组中腹泻率和腹泻程度最高;采用高剂量病毒组的实验方法,扩大造模动物的数量进行验证,1 dpi乳鼠腹泻率为80.0%,腹泻程度达3.1,并连续4 d保持腹泻状态。结论：4 d龄昆明小鼠乳鼠被Wa株轮状病毒经口攻击后,病毒能够使昆明小鼠乳鼠出现腹泻表现,且腹泻率和腹泻程度与病毒滴度、剂量相关。所建模型方法简便、重现性好,可作为比较理想的动物模型用于抗RV感染的药物治疗效果评价。     

干扰素对轮状病毒的作用

本文首次报道了人白细胞干扰素(Le IFN)对人轮状病毒的作用。体外实验表明,MA104细胞对人Le IFN敏感,人Le IFN能抑制轮状病毒Wa株对MA104细胞的致病作用。临床观察说明低剂量的粗制白细胞干扰素(5万IU/ml)对轮状病毒胃肠炎有明显的疗效,与常规对症治疗比较,肌注组不论在全病程或用药后治愈天数上均有极明显的缩短(P<0.001),但有发热的付作用。灌肠组亦有显著的疗效(P<0.01),虽逊于肌注组,但无明显付作用。本文建议用部分纯化IFN肌注可能会减少付反应或加大粗IFN的灌肠剂量可望提高疗效。     

噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒检测中的应用

目的:探讨噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒滴度检测中的应用。方法:用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂进行空斑形成实验MDCK和Hep-2细胞在12孔板上形成单层后,分别感染流感病毒和呼吸道合胞病毒,加入单层琼脂糖代替传统双层琼脂糖培养3-4天,用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂计数空斑。结果:⑴MTT法空斑形成实验检测流感病毒和RSV病毒滴度操作简单,时间短;⑵与常规中性红法空斑形成实验比较检测病毒滴度没有差异;⑶MTT法可以避免假空斑形成。结论:MTT法空斑形成实验可替代中性红法空斑形成实验,且更快速、准确。     

轮状病毒感染成年小鼠的研究

目的研究成年昆明种小鼠对实验感染人轮状病毒(rotavirus,RV)的敏感性。方法在实验条件下,用A组人Wa和恒河猴SA11株RV感染成年昆明种小鼠,观察小鼠的临床反应和排毒情况。结果成年昆明种小鼠感染Wa和SA11RV第二天后出现明显的临床腹泻症状,第四天达到高峰;至少在感染后连续6天的动物大便中可检测到较高滴度的RV抗原。结论成年昆明种小鼠对RV感染有很高的敏感性,可做为动物模型,在RV感染的药物治疗效果评价和疫苗保护性效果评价中具有重要价值。     

夏季成人腹泻暴发流行中的一种新的轮状病毒

1983年夏在皖南歙县发生了一次非细菌性成人腹泻暴发流行,病例总数达20,000人以上。传播途径没有查清。用直接电镜和免疫电镜检查,发现在病人粪便中有一种病毒,其形态与普通轮状病毒非常相似,但经补体结合和ELISA试验二者之间无抗原联系。又经基因组核酸分析,发现二者的核酸电泳图型明显不同。故证明这是一种新的轮状病毒。     

The role of trypsin in plaque formation by simian rotavirus SA-11

The role of trypsin in plaque production by simian rotavirus SA-11 monolayers of MA-104 cells are investigated. Initial trypsin treatment of the virus alone or its presence only during the early phases of virus-cell interaction was found to be insufficient for plaque production by the virus. Presence of trypsin (5 microgram/mL) in the agar overlay throughout the five day incubation period was essential for the optimal development of the virus plaques. Production of plaques by the incorporation of trypsin in the overlay was not due to the enzymatic degradation of any plaque-inhibitors in the agar used. Experiments using high (4 PFU/cell) and low (35 PFU/10(6) cells) multiplicities of infection suggest that trypsin added to fluid maintenance medium facilitates the cell-to-cell spread of progeny virus particles. Therefore, the enzyme incorporated in the agar overlay appears to play a similar role thereby assisting in the formation of SA-11 plaques.     

轮状病毒感染中血清抗体对病毒多肽的反应性

建立人轮状病毒(HRV)电转印免疫印迹技术(electrotransfering immunoblotting,ETIB)分析了3个不同血清型别的HRV抗原与同型及异型豚鼠抗血清的ETIB反应。在此基础上,以HRV Wa,Yo,Hochi株为抗原,用ETIB法检测46例急性腹泻患儿,17例正常婴幼儿及30例脐带血血清中抗HRV各种多肽的抗体及其出现的动态。结果提示,不同血清型HRV每株的内外衣壳蛋白之间,分别具有共同的某些抗原决定簇。根据HRV ETIB反射扫描结果分析,HRV毒株之间其Vp3,Vp7显示出血清型别的特异性。HRV感染的病儿对Vp2、Vp6的抗体免疫反应性较强。各类多肽抗体的出现似有时间上的序次,其中以Vp6的抗体出现于病程的早期,其次是VpZ抗体。此外还发现病人血清HRV-ETIB反应阳性与自粪便中检出HRV-RNA阳性结果具相关性;在7例HRV-ETIB抗体阳性的脐血和正常婴幼儿血清中,均未发现VpZ的抗体。     

重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性

目的评价重组表达的轮状病毒(RV)抗原表位疫苗的小鼠体内保护效果及安全性.方法在以FlockHouse virus病毒外壳蛋白为载体的外源抗原表位呈递系统(FHV-RNA2系统)中构建和重组表达RV Vp4蛋白上第223～262位抗原表位(REABC);在原核系统[质粒pET,大肠杆菌BL21(DE3)]中表达的REABC免疫小鼠用细胞培养适应的参照RV Wa(G1PA型)和SA11(G3P2型)经口腔灌胃攻击,对RV攻击后的免疫小鼠和对照小鼠的感染症状、排毒情况、血清抗体中和病毒感染性效价进行测定和分析.结果REABC可诱导免疫小鼠产生较强的抗-Wa和抗-SA11株血清中和抗体和特异的免疫记忆反应,有效保护免疫小鼠对Wa和SA11的攻击(不腹泻),减少病毒在体内复制水平和排毒时间,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论重组表达RV抗原表位REABC对小鼠具有较好的免疫保护效果和安全性.     

Molecular biology of rotavirus cell entry

Rotaviruses, the leading cause of severe dehydrating diarrhea in infants and young children worldwide, are non-enveloped viruses formed by three concentric layers of protein that enclose a genome of double-stranded RNA. The entry of rotaviruses into epithelial cells appears to be a multistep process during which at least three contacts between the virus and cell receptors occur. Different rotavirus strains display different requirements to infect cells. Some strains depend on the presence of sialic acid on the cell surface; however, interaction with a sialic acid-containing receptor does not seem to be essential, because variants that no longer need sialic acid to infect the cells can be isolated from sialic acid-dependent strains. Comparative characterization of the sialic acid-dependent rotavirus strain RRV, its neuraminidase-resistant variant nar3, and the human rotavirus strain Wa have allowed to show that alpha2beta1 integrin is used by nar3 as its primary cell attachment site, and by RRV in a second interaction subsequent to its initial contact with a sialic acid-containing cell receptor. These first two interactions are mediated by the virus spike protein VP4. After attaching to the cell, all three strains interact with integrin alphaVbeta3 and protein hsc70, interactions perhaps important for the virus to penetrate into the cell's interior. The cell molecules proposed to serve as rotavirus receptors have been found associated with cholesterol and glycosphingolipid-enriched lipid microdomains, and disorganization of these domains greatly inhibits rotavirus infectivity. We propose that the functional rotavirus receptor is a complex of several cell molecules most likely immersed in plasma membrane lipid microdomains.     

新西兰孕兔人轮状病毒Wa株宫内感染的初探

目的观察孕免人轮状病毒（ＨＲＶ）血症是否会导致富内感染。方法在新西兰孕兔妊娠的不同阶段,经耳静脉注射入轮状病毒Ｗａ株,造成孕兔的病毒血症（血浓度为５×１０７／Ｌ）,然后用ＲＴ／ＰＣＲ技术;检测出生仔兔肠道组织内ＨＲＶ抗原。结果在孕兔妊娠的早、中,晚期,ＨＲＶ都能通过血胎屏障进入宫内在仔兔肠道内定居。结论提示仔免存在ＲＶ宫内感染的可能性。这将为研究人类ＲＶ宫内感染提供依据。     

A comparison of some serological tests for bluetongue virus infection.

The plaque neutralization, complement fixation, and agar gel precipitin tests were compared by measuring bluetongue virus antibody in 137 serums from experimental animals (cattle and sheep) and suspected field reactors (cattle and deer). In general, the tests agreed well with each other. Plaque neutralization titers began earlier than the other two and went much higher than the complement fixation titers. Plaque neutralization titers usually peaked between two and three weeks after exposure and complement fixation titers from four to six weeks. The greater sensitivity of the plaque neutralization test allowed the detection of all complement fixation and agar gel precipitin reactors whereas occasionally the latter two tests failed to detect plaque neutralization reactors.     

Avian reovirus antibody assay by indirect immunofluorescence using plastic microculture plates

An indirect fluorescent antibody test was developed to detect serum antibody to avian reovirus strain WVU2937. This test employed small multiple well plastic plates (8 x 5.5 cm) which readily fitted into the standard mechanical stage mechanism of an incident light fluorescence microscope. The small wells of the plates required minimal (10 muL) volumes of reagents. In tests on 18 sera in which the indirect fluorescent antibody, agar gel precipitin and plaque reduction methods were compared sera which gave negative results in the agar gel precipitin test were sometimes positive in the indirect fluorescent antibody and plaque reduction test, but indirect fluorescent antibody titers were lower than plaque reduction test titers. No false positive reactions were detected in 46 sera from uninoculated specific pathogen free chicks of up to eight weeks of age.