TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。方法 采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。结果 菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高（P<0.05）。结论 成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升...     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.用脂质体2 000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线.结果 构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞.     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

阿片肽结合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建阿片肽结合蛋白的真核表达载体。方法：从人卵巢上皮组织中提取总RNA进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,扩增出阿片肽结合蛋白（OPCML）基因片段,与真核表达载体pcDNA4/HisMaxB连接,得到重组载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML,并酶切鉴定和测序。结果：真核表达载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML中OPCML基因的序列和插入方向均正确。结论：本实验成功构建了阿片肽结合蛋白真核表达载体。     

人HNF1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)真核表达载体,在体外表达并检测.方法 提取HepG2总RNA,用RT-PCR方法制备HNF1α cDNA,进行T-A 克隆.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切测序正确的重组质粒,回收HNF1α cDNA片段,将其亚克隆于pcDNA3.1( )载体的多克隆位点内.将构建好的真核表达质粒用脂质体法转染HepG2细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测HNF1α的表达. 结果正确构建了pcDNA3.1( )-HNF1α重组载体,并且在转染该质粒的HepG2细胞中检测出了HNF1α的高表达. 结论成功地构建了人HNF1α真核表达载体,其可以在体外表达.     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

iASPP真核表达载体构建及其功能鉴定

目的构建P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族的抑制成员iASPP的真核表达载体,并将其通过脂质体转染到结肠癌细胞株SW480及Lovo中,观察转染前后iASPP表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法将解放军第十六医院检验科经测序鉴定的pMD19-T-iASPP质粒亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,测序鉴定后用脂质体将重组质粒转染至结肠癌细胞株SW480及Lovo中,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。结果重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,经酶切测序与GenBank上记录的人iASPP cDNA序列(gi 60457962)完全一致。经pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW480及Lovo的iASPP mRNA表达增高,细胞凋亡率下降。结论成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,并成功在结肠癌细胞株SW480及Lovo中获得了表达,细胞株的凋亡率下降,提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复P53抑癌功能的新策略。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

三叶因子2基因真核表达载体的构建

目的：构建TFF2-pcDNA3．1真核表达载体．方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2,然后TA克隆于pGM—T easy载体中．阳性克隆经测序鉴定．再经双酶切消化后,插入真核表达载体pcDNA3．1上,经酶切鉴定与测序证实．结果：合成的TFF2经TA克隆后,筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定,与设计的TFF、2基因序列完全一致．经酶切连接并成功插入pcDNA3．1上．结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础．     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法:EcoRI,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1 600 bp小片段,连接入pcDNA3.1载体.经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照.G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆.①细胞用阿霉素处理6 h后Western blot法检测TRF2表达.②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响.结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P＞0.05).结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础.     

UCA1a(CUDR) 基因真核表达载体的构建及其在膀胱癌UM-UC-2 细胞中的表达

目的：构建 UCA1a(CUDR) 基因真核表达载体 pcDNA-UCA1a(CUDR),观察其在膀胱癌 UM-UC-2 细胞中的表达,为研究 UCA1a(CUDR) 基因与膀胱癌的关系提供实验依据。方法：以膀胱癌 BLZ-211 细胞的 5′-RACE-Ready cDNA 为模板,采用 PCR 法克隆 UCA1a(CUDR) 全基因,经EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切后与真核表达载体 pcDNA3.1(＋) 连接,构建 pcDNA-UCA1a(CUDR) 重组质粒。双酶切及测序鉴定后,稳定转染至体外培养的人膀胱癌 UM-UC-2 细胞系,利用 RT-PCR法检测转染 pcDNA-UCA1a(CUDR) 的 UM-UC-2 细胞和转染空质粒 pcDNA3.1(＋) 的 UM-UC-2 细胞中 UCA1a(CUDR) 基因的表达。结果：克隆的目的基因片段约为 2 200 bp,与预期结果相符,表明成功扩增 UCA1a(CUDR) 基因;经双酶切及测序鉴定,成功构建真核表达载体pcDNA-UCA1a(CUDR)。半定量 RT-PCR 法检测,与转染空质粒的细胞比较,转染表达载体 pcDNA-UCA1a(CUDR) 的UM-UC-2 细胞中 UCA1a(CUDR) 基因表达量升高。结论：成功构建pcDNA-UCA1a(CUDR)真核表达载体,且UCA1a(CUDR) 基因在转染表达载体的 UM-UC-2 细胞中高表达。     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体，并分析其在HEK293细胞中的表达。方法 从重组pcDNA3／HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上，经PCR、酶切和测序鉴定，将重组质粒pcDNA3-flag／HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞，细胞裂解后，用Western blot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果 PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag／HPC2构建正确，并可在HEK293细胞内高效表达。结论 成功构建了pcDNA3-flag／HPC2真核表达载体，该载体能在哺乳动物细胞中有效表达，为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。     

大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 ,为肿瘤细胞的GA反义基因治疗研究创造条件     

pIRES2-AcGFP1-sTRAIL真核表达载体的构建及鉴定

目的利用基因工程技术合成sTRAIL（水溶性TRAIL）基因,并以AcGFP为报告基因,构建针对sTRAIL基因的pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒。方法从人胎盘组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增sTRAIL,并加入XhoI和BamHI酶切位点,通过双酶切将其连接于表达载体pIRES2-AcGFP1,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒构建的正确性,最后用pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒转染Hela细胞利用倒置荧光显微镜直接观察表达情况。结果酶切、PCR及测序结果证实pIRES2-AcGFP1-sTRAIL构建序列正确。结论利用基因工程技术成功构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-sTRAIL,为后续抗肿瘤研究奠定了基础。