超广谱β-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达，为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，自行设计一对寡核苷酸引物，通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断，定向克隆入质粒载体pBK—CMV构建重组质粒，对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定，重组质粒转化大肠埃希菌XL1-Blue MRF’后，Nitrocefin显色结合SDS—PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带，定向克隆入质粒载体pBK—CMV后筛选到大小约为5．4kb的重组质粒，SacⅠ和EcoRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段，DNA测序发现插入片断的基因序列与GenBank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致，重组质粒转化大肠埃希菌XL1-Blue MRF＇后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对nitrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL1-Blue MRF＇中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体，为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT-PCR方法，用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增hPARP-1基因片段，并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α，用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆，抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果 经RT-PCR获得507bp含限制性内切酶位点的阳性产物，T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实，克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99．9％。结论 该实验成功地构建了含hPAR-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆，为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具。     

肿瘤坏死因子受体2编码基因重组质粒的构建及意义

目的构建真核表达质粒pcDNA6.0-TNFR2~196MET和pcDNA6.0-TNFR2~196ARG。方法人工合成TNFR2~196MET目的片段,与pMD18-Tsimple载体连接形成克隆载体,再通过设计突变引物,PCR定点突变扩增出含有突变位点的质粒,转化到肠埃希菌感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增。抽提质粒进行测序鉴定,得到pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG。双酶切pMD18-Tsimple-TN-FR2196MET、pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG及pcDNA6.0,将TNFR2196MET、TNFR2196ARG插入pcDNA6.0线性质粒,即构建成pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG真核表达质粒,转化到Ecoli感受态中,筛选阳性克隆行菌液PCR和双酶切及测序鉴定。结果酶切鉴定和测序分析验证TNFR2基因196MET和196ARG表达载体构建成功。结论成功构建表达载体为下一步心血管疾病研究奠定了实验基础。     

鲶鱼抗菌肽Parasin Ⅰ原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)原核表达载体.方法 根据Parasin Ⅰ氨基酸序列及大肠埃希菌偏爱密码原则设计并合成Parasin Ⅰ基因寡核苷酸片段,将其与表达载pGEX-4T-1经限制性核酸内切酶双酶切后连接,转化至大肠杆菌BL21,挑取阳性菌落,抽提重组质粒并鉴定,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯...     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)Cag致病岛(Cag-PAI)编码的Cag3(hp0522)基因重组质粒,转入大肠杆菌中表达,纯化重组蛋白.方法 以Hp 11637基因组为模板,应用PCR技术扩增Cag3基因片段,克隆至pGEM-T载体中测序,然后克隆到高效表达载体pET-28a(+)上,得到了重组表达载体pET-28a(+)-Cag3,转化表达宿主菌大肠埃希菌BL21;经IPTG诱导表达后,将大量表达的重组蛋白用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化;采用串联飞行时间质谱技术对Cag3-His融合蛋白进行鉴定.结果 成功克隆了Cag3基因.经SDS-PAGE分析,表达蛋白相对分子质量与预期大小一致;质谱检测到Cag3重组蛋白的表达.结论 成功构建了Cag3基因的原核表达载体pET-28a(+)-Cag3.     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。     

不同方法治疗慢性宫颈炎的疗效分析

目的慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一,可引起盆腔脏器炎症,并且与宫颈癌的发生关系密切。本文诣在探讨不同方法在慢性宫颈炎中的疗效。方法回顾性分析新乡市中心医院收治的210例宫颈炎患者,采用药物保妇康栓、聚焦超声治疗及宫腔镜下宫颈电切术的临床效果进行统计分析。结果宫颈电切术治疗有效率为97.9%,明显高于另外两组,差异有统计学意义。结论宫腔镜下宫颈电切术治愈慢性宫颈炎,并且切除宫颈移行带,减少宫颈癌发生。     

片剂溶出度影响因素分析

目的:考察片剂溶出度的影响因素,提高片剂溶出度,从而提高产品质量。方法:通过实验,研究各种参数对片剂溶出度的影响,选择出最佳工艺条件,如改进处方、控制颗粒硬度和大小、控制压力等工艺参数,用于指导大型生产,提高片剂溶出度。结论:崩解剂及润滑剂的用量对片剂溶出度影响较大,颗粒的硬度及大小、粘合剂的温度,压片压力对片剂的溶出度亦有影响;片剂直径大小对片剂溶出度影响不大。     

住院患者抗菌药物不合理使用分析

目的了解该院住院患者不合理使用抗菌药物情况。方法随机抽取2009年住院使用抗菌药物病历544份。依据《抗菌药物临床使用原则》等相关规定进行评价,统计、分析抗菌药物不合理使用现象。结果该院住院患者抗菌药物不合理使用率为31.8%,不合理现象主要表现有选药不当、高起点用药、用法用量不当等。结论该院住院患者抗菌药物不合理使用现象严重,医院应采取措施加强监管,促进抗菌药物合理使用。     

对天津市北辰医院医务人员药品不良反应认知度调查分析

药品不良反应(ADR)监测工作是对上市药品安全性的再评价,是公众安全合理用药的保障,是药品监督管理工作的重要组成部分。本中心对天津市北辰医院103名医务人员进行了药品不良反应相关知识认知度调查,并对调查结果进行统计分析,为相关部门的药品监管工作提供依据和参考。     

槲皮素代谢产物定性检出条件研究

目的:研究给予大鼠槲皮素后血浆中代谢产物的定性检出条件。方法:给予大鼠槲皮素单体(100mg.kg-1)后腹腔静脉取血,血浆样品经2mol.L-1盐酸(甲醇-水溶液)水解,采用高效液相色谱法对血浆样品中代谢产物进行定性分析。结果:大鼠给药后3h内取血、血浆样品经盐酸水解处理4h,可稳定检测槲皮素和异鼠李素,样品在—20℃条件下贮存稳定。结论:血浆样品采集时间、盐酸水解时间及贮存方式等不同均可影响代谢产物的有效检出。     

早产儿视网膜病变141例自然退行与进展的影响因素分析

目的 通过分析早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity,ROP）自然退行和进展的影响因素,了解ROP的发展规律,以期对ROP病儿的临床及筛查工作有一定指导作用。方法 收集2018年9月至2021年4月在徐州医科大学附属医院就诊并进行眼底筛查的病儿472例。收集确定有眼底病变的141例病儿的临床资料,退行组107例,需干预治疗的进展组34例,分析早产儿视网膜病变自然退行与进展的影响因素。结果 退行组和进展组平均胎龄分别为（31.61±2.29）周、（29.76±1.82）周,经独立样本的t检验,差异有统计学意义（P<0.05）,两组出生体质量的中位数分别为1.58(1.25,1.82)kg、1.26(1.03,1.48)kg,无创通气时间为8.50(6.00,18.75)d、20.00(10.75,32.25)d,两组合并支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）的占比分别为40.2%(43/107),79.4%(27/34),败血症59.8%(64/107)、82.4%(28/34)、贫血59.8%(64/107...     

甲泼尼龙佐治毛细支气管炎疗效观察

目的探讨甲泼尼龙与布地奈德治疗毛细支气管炎的疗效。方法将182例毛细支气管炎患儿随机分成三组,三组均采用综合治疗,A组62例用甲泼尼龙静脉滴注,B组60例雾化吸入布地奈德,C组60例用静滴氢化可的松,观察三组喘憋、哮鸣音消失和住院时间。结果A组喘憋、哮鸣音消失时间及住院时间均比B,C组缩短（P〈0.05）。结论甲泼尼龙静滴治疗毛细支气管炎有效、安全、方便,明显加快治愈过程,优于布地奈德与氢化可的松。