EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P<0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

EB病毒LMP1表达对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期分布的影响

目的:观察EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的作用。方法:用免疫组化(LSAB)法检测LMP1蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的增殖能力;用流式细胞术检测细胞周期的分布。结果:表达LMP1的鼻咽癌细胞系L-CNE1的OD值明显高于LMP1阴性的鼻咽癌细胞系V-CNE1和CNE1(P＜0.001)。L-CNE1细胞系的G₁期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加,与V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著性差异(P＜0.001)。而V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率则无明显差异(P＞0.05)。结论:EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞系细胞周期分布改变和增殖能力增强。     

下调整合素连接激酶表达抑制鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f的增殖

目的探讨整合素连接激酶(ILK)在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f中的表达水平。用下调ILK表达水平和使用ILK特异性小分子抑制剂方法,研究ILK表达对鼻咽癌细胞增殖的影响及意义。方法用免疫组化法检测鼻咽癌组织和普通鼻咽组织中ILK的表达情况,用qRT-PCR和Western blot检测ILK在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f中RNA和蛋白表达水平,用MTT法检测对鼻咽癌细胞增殖的影响。结果 ILK的表达水平在NPC组织中呈阳性或弱阳性,普通鼻咽组织中呈阴性。在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f细胞中siILK能显著降低ILK的表达水平(P0.05),siRNA下调ILK表达能抑制鼻咽癌细胞增殖能力(P0.05),ILK特异性小分子抑制剂(Cdp22)能够显著抑制鼻咽癌细胞系增殖能力(P0.05)。结论下调ILK表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖,为鼻咽癌患者提供新的治疗靶点。     

转酮酶样蛋白1在人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用

目的:探讨转酮酶样蛋白1(TKTL1)在体外培养的人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用.方法:构建针对TKTL1 mRNA 的干扰RNA质粒,转染人类鼻咽癌细胞(CNE细胞系);检测转染前后CNE细胞中转酮酶活性的变化;实时定量RT-PCR检测转染前后CNE细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化;通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后CNE细胞增殖和细胞周期的改变.结果:实验组CNE细胞中转酮酶活性(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)明显低于质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未转染细胞);实时定量RT-PCR结果显示转染前后CNE细胞中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平均无显著差异.然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平明显低于对照组,且实验组CNE细胞增殖明显被抑制,癌细胞被阻滞在G0/G1期.结论:转酮酶蛋白TKTL1在人类鼻咽癌细胞的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl-2表达和凋亡的关系

目的 :探讨ＥＢ病毒ＬＭＰ1表达的促鼻咽癌细胞生长作用与ＣＤ2 3、ｂｃｌ- 2表达和细胞凋亡的关系。方法 :用免疫组化ＬＳＡＢ法检测ＬＭＰ1、ＣＤ2 3和ｂｃｌ- 2蛋白的表达 ;用ＭＴＴ法测定鼻咽癌细胞的生长能力 ;用ＤＮＡ电泳法、流式细胞仪测定法和末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志 (ＴＵＮＥＬ)法检测癌细胞凋亡 ;用ＭＴＴ法观察ＣＤ2 3单克隆抗体对鼻咽癌细胞生长能力的影响。结果 :用含ＬＭＰ1基因质粒转染并表达ＬＭＰ1的鼻咽癌细胞 (Ｌ -ＣＮＥ1 )在 1 5%血清和无血清培养液培养下的生长能力均明显增强 ,并表达ＣＤ2 3蛋白 …     

miR-129抑制鼻咽癌细胞系CNE2增殖

目的检测miR-129对鼻咽癌细胞系CNE2细胞生物学功能的影响。方法人工合成miR-129模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),转染至鼻咽癌CNE2细胞中,RT-qPCR检测细胞miR-129表达;CCK8法检测细胞增殖;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡能力。结果与对照组相比,转染miR-129 mimics组的miR-129表达水平明显升高(P0.05);转染miR-129 inhibitor组的miR-129表达水平均明显降低(P0.05);与对照组相比,转染miR-129 mimics组CNE2细胞增殖能力、侵袭能力显著下降(P0.05),凋亡显著增多(P0.05);与对照组相比,转染miR-129 inhibitor组CNE2细胞增殖能力、侵袭能力显著升高(P0.05),凋亡显著下降(P0.05)。结论 miR-129抑制鼻咽癌细胞系CNE2的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。     

端粒酶RNA反义核酸降低鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平

目的:研究端粒酶活性抑制后鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平的变化。方法:脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组化法检测端粒酶逆转录酶(hTRT)和p53蛋白表达水平。结果:端粒酶RNA反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量依赖性,流式细胞仪检测出现凋亡峰,反义寡核苷酸组hTRT和p53蛋白表达水平显著低于其它处理组及空白对照组(P＜0.01)。结论:端粒酶RNA反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性后可降低p53蛋白表达水平。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

hTR反义寡核苷酸对不同鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的 :研究端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 :脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株 ,用细胞体外增殖实验、免疫组织化学S P法 ,观察细胞生长分化的变化情况。结果 :针对端粒酶RNA模板区的反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量和时间依赖性 ,反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达高于其它处理组及空白对照组 (P <0 0 1) ,细胞形态趋向分化成熟。结论 :端粒酶反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞的生长 ,并促进细胞分化。     

钙蛋白酶小亚基Capn4在鼻咽癌细胞CNE2中DNA损伤修复的作用

目的　研究钙蛋白酶小亚基Capn4对放射所致的鼻咽癌细胞CNE2在DNA损伤修复中的作用及可能影响的修复通路。 方法　选取鼻咽癌细胞CNE2与293T细胞在37℃、5％CO2条件下培养,Western blot法检测Capn4在不同细胞中蛋白表达水平;构建shRNA下调Capn4表达的CNE2细胞并以Western blot法验证;高内涵细胞成像分析仪分析γ-H2AX在放射后的CNE2细胞及下调Capn4表达的CNE2细胞中的平均荧光强度;非同源末端连接（NHEJ）通路特异性的质粒EJ5-GFP用Fugen6 HD转入空载的CNE2细胞及下调Capn4的CNE2细胞,用高内涵细胞成像分析仪检测GFP的阳性率,观察下调Capn4对放射诱导的鼻咽癌细胞DNA损伤NHEJ修复通路的影响。 结果　Capn4在鼻咽癌细胞系中表达明显高于正常细胞（P<0.01）;shRNA确实下调Capn4在鼻咽癌细胞中的表达;下调Capn4表达对放射造成的CNE2细胞DNA损伤修复有抑制作用（P<0.01）;下调Capn4表达能够抑制CNE2细胞DNA损伤后NHEJ通路的修复（P<0.01）。 结论　Capn4在鼻咽癌细胞CNE2中高表达,下调Capn4的表达能抑制放射所致的DNA损伤修复,这种作用可能是通过抑制NHEJ通路实现的。     

EBV-LMP及二甲基亚砜对人鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的：研究ＥＢＶ－ＬＭＰ及二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）对人鼻咽癌（ＮＰＣ）细胞体外生长分化的影响。方法：以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象，采用电穿孔基因转染技术，将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞，以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照，用细胞体外增殖实验、流式细胞仪和免疫组化等方法，观察细胞生长分化的变化情况。结果：ＥＢＶ－ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞的增殖，实验组与空白组及阴性对照组比较Ｐ＜０．０１，实验组Ｓ期细胞明显增多，细胞角蛋白表达显著下降（Ｐ＜０．０５），有向低分化鳞癌发展倾向；ＤＭＳＯ诱导后ＣＮＥ１细胞增殖力明显下降（Ｐ＜０．０１），细胞角蛋白表达显著增高（Ｐ＜０．０１）；ＬＭＰ可明显抑制ＤＭＳＯ对ＣＮＥ１细胞的诱导分化作用，转染细胞诱导后增殖力和角蛋白表达无显著改变（Ｐ＞０．０５）。结论：ＤＭＳＯ可在一定程度上诱导ＣＮＥ１细胞分化；ＥＢＶ－ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用，可抑制细胞分化及降低细胞对终末分化信号的反应，有助于深入研究ＮＰＣ的发生机理及防治     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

EB病毒潜伏膜蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE1生长分化的影响

目的 研究ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＥＢＶ－ＬＭＰ）对人高分化鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象,采用电穿孔基因转染技术,将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞。以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照,用细胞体外增殖实验、流式细胞信（ＦＣＭ）和裸鼠体内丰瘤实验等,观察细胞生长分化的变化。结果 ＥＢＶ－ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞地增殖,实验组平均吸光度（Ａ）     

MDM2 expression in EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells

To understand whether the p53-regulated mdm2 gene expression was altered by the Epstein-Barr virus (EBV) in nasopharyngeal carcinoma (NPC), the NPC-TW01 cell line was infected by EBV through IgA receptor-mediated endocytosis. The mdm2 gene was expressed only in a small fraction of the NPC cell population and could be enhanced in the EBV-infected (EBV+) cells. In the animals bearing EBV+ and EBV- NPC xenografts, the MDM2+ cells only appeared in clusters in both EBV+ and EBV- tumors with stronger expression in EBV+ cells. Cotransfection of pmdm2-Luc plus pSV40-p53 plus pCMV-LMP1 in the NPC-TW06 line that had p53 heterozygous point mutation showed stronger mdm2 promoter activity than cells cotransfected with pmdm2-Luc plus pSV40-p53, but no mdm2 promoter activity was seen in cells cotransfected with pmdm2-Luc plus pCMV-LMP1. Only the EBV-LMP1 but not the EBV-LMP2A gene could enhance p53 to upregulated mdm2 expression. Tumor cells in NPC biopsy specimens revealed similar mdm2 expression as in the animal model. It is concluded that although EBV can indirectly enhance mdm2 gene expression in tumor cells that express this gene, it cannot turn on or directly regulate mdm2 expression in cells that do not express this gene. In other words, EBV plays a role as an enhancer in NPC tumorigenesis.     

受体酪氨酸激酶Axl高表达促进鼻咽癌临床进展

目的:探讨受体酪氨酸激酶anexelekto(Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表达,分析Axl蛋白表达与NPC患者临床参数的相关性。常规培养NPC细胞,免疫荧光法检测不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表达情况。应用Axl特异性抑制剂TP-0903处理CNE1和C666-1细胞,CCK-8实验检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞周期的分布,q PCR检测Axl和增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达,Western blot检测Axl及p-Axl蛋白的表达。结果:Axl蛋白定位于胞膜和胞质。NPC中Axl高表达阳性率显著高于鼻咽黏膜慢性炎(P0.01)。Axl高表达与患者年龄、性别及M分期无关,与临床分期、T分期和N分期呈正相关(P0.05)。Axl在高分化CNE1细胞中低表达,在低分化CNE2Z细胞和未分化C666-1细胞中表达水平明显增高。TP-0903呈浓度和时间依赖性抑制NPC细胞的活性,2 nmol/L TP-0903即具有显著抑制效应,能阻滞细胞周期于G0期,在降低Axl活性的同时也显著抑制PCNA的表达。结论:Axl高表达可促进NPC的临床进展;TP-0903显著抑制NPC细胞的增殖,提示Axl可能在NPC靶向治疗中具有一定的价值。     

CD21非依赖性EB病毒对人胃印戒细胞癌细胞系的感染

目的　探讨CD2 1非依赖性EB病毒 (EBV)对人胃印戒细胞癌细胞系 (HSC 39)的感染作用。方法　用Akata和P3HR 1EBV毒株感染HSC 39,有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果　两种EBV毒株感染细胞中均可检测到EBV编码的小RNA(EBER)的表达 ,两种EBV毒株感染的亲代细胞及大多数细胞克隆表达EBV核抗原 (EBNA1) ,但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白 (LMP1)和LMP2A。表现为潜伏Ⅰ型感染。未感染的HSC 39细胞及P3HR 1感染的细胞克隆CD2 1表达阴性 ,而AkataEBV感染的部分细胞克隆CD2 1mRNA阳性。结论　EBV可能通过不依赖CD2 1受体的途径感染HSC 39,印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。