聚甘露糖醛酸硫酸酯及寡糖在表达FGFR1c的BaF3细胞中可激活FGF1/19/21信号通路

目的 近几年来发表的数据显示成纤维细胞生长因子(FGFs),包括FGF1, FGF19和FGF21, 具有类似于胰岛素的代谢调节功能。例如,在饮食诱导的糖尿病小鼠中,FGF1的单次注射足以使血糖水平恢复到正常范围;同时FGF19或FGF21过表达可以校正糖耐量受损的小鼠。在细胞表面,FGFs通过FGF受体(FGFR)和糖胺聚糖进行信号传导。FGF1与属于糖胺聚糖的肝素具有高亲和力,而FGF19和FGF21与肝素无亲和力。糖胺聚糖结构多样,是信息含量最高的生物大分子。我们认为如果非肝素类多糖可以刺激FGF19/FGFR和FGF21/FGFR的信号传导,这类化合物有可能成为调节代谢疾病的新型药物。方法 我们采用表达FGFR1c的BaF3细胞作为筛选具有活性多糖与寡糖的模型。结果 发现聚甘露糖醛酸硫酸酯(PMS)及寡糖(PMS12及PMS25)可以增强FGF19和FGF21介导下的BaF3细胞中 ₃H-胸苷嘧啶标记的DNA合成,而聚甘露糖醛酸(PM)无此作用。此外,PMS,PMS寡糖包括其二糖与肝素类似具有增强FGF1/FGFR1c信号通路介导的BaF3的细胞增殖作用。结论 由于PMS及其寡糖可通过口服途径被吸收,因此这些廉价的海藻酸衍生物有可能通过增强FGF1/FGFR1c,FGF19/FGFR1c和FGF21/FGFR1c的信号传导而被开发成为治疗2型糖尿病的新型口服药物。     

sFGFR3的原核表达及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

成纤维细胞生长因子(FGFs)是一类高效的细胞分裂、成形促进剂,以及血管生成的诱导物。FGF信号通路是与癌症的发生和发展紧密相关的。可溶性成纤维细胞生长因子受体(sFGFRs)能够与FGFs相结合,从而阻断它们的信号。为了研究sFGFR3对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,作者利用从人类胎盘组织中提取的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR),扩增了FGFR3IIIc的胞外域(sFGFR3)。克隆了sFGFR3片段并将其插入到pET3c载体中,然后在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式进行表达。通过凝胶层析和肝素亲和层析,分离和纯化了成功重折叠的蛋白。sFGFR3的重折叠率为10.2%,纯化后的蛋白其纯度高达95%。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)处理后的细胞扩增分析结果显示,sFGFR3能够有效抑制乳腺癌细胞BT549的增殖,且其抑制不具有剂量依赖性。     

成纤维细胞生长因子2在纤维化疾病中表达的研究进展

成纤维细胞生长因子2(FGF-2)是一种促进血管生成的因子,能够在多种细胞和组织中表达,并参与细胞迁移、细胞分化和各种发育过程.虽然FGF-2缺乏经典的分泌信号肽,但其可以通过结合高亲和力的跨膜FGF受体(FGFR)和辅助因子硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)以FGF-2-HSPG-FGFR三元复合物的形式在细胞内发生磷...     

成纤维细胞生长因子抑制剂的研究进展

成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor,FGF)是一个包括多个成员的多肽家族 ,在细胞的分化和发展中起到一系列重要作用。它们具有许多生物学特性 ,尤其是在促有丝分裂和血管形成方面。FGF的活性主要是通过结合和激活其受体FGFR来实现的。FGFs/FGFRs信号传递与肿瘤的发生发展密切相关。多数肿瘤细胞过量表达FGFR和aFGF/bFGF ,从而形成自分泌信号环路。此信号环路主要以两种机制参与肿瘤的形成和发展 :刺激肿瘤细胞过度增生 ;形成新生血管为肿瘤细胞提供营养[1 ] 。本文介绍了几类抑制剂 ,它们能阻止FGF与其高、低亲和力受…     

环境暴露和FGF18、FGFR1、FGF10和PVRL2等基因多态性与NSCL/P的关系

目的 探讨环境暴露、FGF18、FGFR1、FGF10和PVRL2等基因多态性及其交互作用与非综合征性唇腭裂(NSCL/P)的关系.方法 对75例NSCL/P患儿和75例非NSCL/P儿童调查了环境、遗传因素,用PCR-RFLP检测FGF18基因rs4043716位点、FGFR1基因rs13317、FGF10基因rs1448037以及PVRL2的rs39358、rs2075642位点基因型,进行单因素x2分析和多因素Logistic 回归分析.结果 遗传因素、父亲文化、母亲孕早期感染史、孕早期服药史、母亲孕早期补充叶酸、FGF18基因rs4043716位点多态性与NSCL/P有关(P<0.05).结论 遗传因素、孕早期感染史、孕早期服药史、FGF18基因rs4043716位点多态性与NSCL/P发生有关,但未发现它们之间存在正交互作用.父亲文化、母亲孕早期补充叶酸是NSCL/P的保护因素.     

成纤维细胞生长因子与其受体的研究进展

成纤维细胞生长因子(FGFs)家族已发现有21个成员，其中哺乳动物有9个。成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是一类穿膜的酪氨酸激酶受体，它们介导FGFs信号传递入细胞质中。目前已经确定了由4种独立基因编码的FGFRs即FGF、R1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。FGFs／FGFRs在不同组织中，通过复杂的信号传递路径对细胞的增值、分化和移行进行调节。由于它们具有广泛的生物学功能，因此在临床应用上具有很大的潜力。     

FGFR2基因多态性与乳腺癌相关性研究

目的研究成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)基因单核苷酸多态性(SNP)与乳腺癌发生相关性。方法实验组为280例乳腺癌患者,对照组为280名健康女性,运用等位基因扩增-聚合酶链反应(ASA-PCR)方法,对其FGFR2基因3个位点(rs2912778、rs2981578、rs2981582)进行检测,并对扩增产物进行测序,分析其中2个位点(rs2912778、rs3135718)单核苷酸多态性与乳腺癌风险关系。结果两个位点(rs2912778、rs3135718)基因型分布及等位基因频率在乳腺癌组和对照组差异具有高度统计学意义(P<0.01)。结论 FGFR2基因两个位点(rs2912778、rs3135718)单核苷酸多态性可能与乳腺癌的发生有关。     

中国人群PRKAG2心脏综合征新突变的PRKAG2基因的功能分析

目的研究中国人群家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚患者新错义突变的PRKAG2基因表达和功能变化。方法利用PCR扩增其功能区外显子片段,双脱氧末段终止测序法来构建表达PRKAG2G100S、PRKAG2R302Q及野生型(WT)PRKAG2基因的慢病毒载体,并对其从细胞学水平进行体外实验研究。结果(1)PRKAG2 G100S和PRKAG2 R302Q突变对PRKAG2基因在CCL13细胞中的表达位置没有影响;(2)PRKAG2突变组CCL13/GS和CCL13/RQ与CCL13/WT组相比,PRKAG2蛋白表达量减少,且细胞质及胞核内有较多糖原沉积;(3)PRKAG2基因G100S和R302Q突变降低了CCL13细胞中的AMPK活性,而G100S突变降低AMPK活性的作用弱于R302Q突变(P<0.05或P<0.01)。结论 PRKAG2G100S突变是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病原因,初步证实了突变导致AMPK活性降低及糖原累积是家系的发病机制;G100S突变可能使PRKAG2基因Bateman结构域功能发生变化,但对Bateman结构域功能的影响弱于R302Q突变。     

亲水突变法提高抗VEGFR2单链抗体的体外亲和力

为了提高抗VEGFR2单链抗体AK404R的亲和力,本研究采用亲水突变法将AK404R的重链CDR3区进行突变,建立次级突变单链抗体库。利用噬菌体展示技术从次级突变库中筛选具有抗VEGFR2特异性、高亲和力抗体,获得的抗体突变株经大肠杆菌HB2151分泌表达,镍亲和色谱柱纯化,并采用竞争性ELISA法、生物信息学方法分别对其亲和力和结构进行了分析。本研究最终建立了6.4×105的次级突变单链抗体库,其中两株突变株的亲和力有明显提高,两株突变株经分离纯化得到电泳纯的蛋白,竞争性ELISA结果显示突变体WZ01和WZ02的亲和力比亲本提高了3倍;生物信息学方法分析突变体与抗原的作用面增大、契合紧密,这可能是亲和力提高的原因之一。研究结果表明,在重链CDR3区引入亲水性氨基酸构建抗体突变库,可有效提高scFv的亲和力。     

角质细胞生长因子对放化疗引起的口腔黏膜炎的防治作用

角质细胞生长因子(KGF)属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族,又称FGF-7,是由间充质来源的细胞所产生,可与FGF受体(FGFR)的亚型FGFR2-Ⅲb特异性结合,通过旁分泌方式作用于上皮细胞,是上皮细胞强有力的有丝分裂原.KGF可通过间质-上皮相互作用的方式促进不同来源组织上皮细胞的增殖、移行、分化.研究显示,KGF对放化疗引起的口腔黏膜溃疡及炎症有防治作用,因而在改善肿瘤放化疗并发症、提高肿瘤治疗效果方面有重要意义.     

遗传性高铁血红蛋白一家系的基因诊断

目的 检测Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症(HM)先证者(L72P,长乐)家系成员的细胞色素b5还原酶(b5R)基因的突变。方法 PCR方法扩增正常人和HM先证者之兄、父、母的b5R基因组DNA片段(含第3和第4外显子);用限制性内切酶Apa Ⅰ分析扩增产物。结果PCR扩增产物用Apa Ⅰ酶切后,正常人为649和471 bp;先证者之兄为649、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子纯合子突变:其父、母均为649、471、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子杂合子突变。结论PCR结合Apa Ⅰ内切酶分析可用于b5R基因第72密码子突变的检测;PCR-RFLP方法是检测人群中b5R基因杂合子突变的简捷有效的方法。     

成纤维细胞生长因子受体 2剪切突变体 Ⅲc在膀胱癌中的表达以及与膀胱癌 253J细胞多柔比星耐药的关系

目的 探讨成纤维细胞生长因子受体2的剪切突变体Ⅲc(FGFR2Ⅲc)与膀胱癌发生发展及膀胱癌253J细胞多柔比星耐药的关系.方法 选取2016年1月至2018年1月郑州市第一人民医院保存的膀胱癌组织标本143例,同时选取正常膀胱组织70例作为对照,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测组织FGFR2Ⅲc表达;选取膀胱癌253J细胞,同时建立耐多柔比星253J细胞,采用MTT法检测最大半数抑制浓度,细胞划痕试验检测细胞迁移.结果 膀胱癌组FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量为(1.782±0.342),明显高于正常膀胱组(P<0.05);病理分级高级别、病理分期T2～T4期FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量分别为(1.945±0.330)和(1.869±0.322),明显高于低级别和Ta～T1期(P<0.05);不同病理分级、病理分期病人性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05);耐多柔比星253J细胞FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量和最大半数抑制浓度分别为(2.001±0.291)和(13.02±1.10)g/L,明显高于253J细胞(P<0.05);耐多柔比星253J细胞迁移率为(23.02±3.12)％,明显低于253J细胞(P<0.05);耐多柔比星253J细胞凋亡率为(23.22±5.50)％,明显低于253J细胞(P<0.05).结论 FGFR2Ⅲc mRNA在膀胱癌组织中表达上调,与病理分级和病理分期有关,同时与253J细胞耐多柔比星、迁移有一定关系.     

晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选

目的构建晚期糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)胞外段基因的原核表达载体并诱导表达,应用噬菌体展示技术筛选其相互作用蛋白。方法用RT-PCR方法扩增人RAGE胞外段cDNA,构建于原核表达载体pET14b,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导RAGE胞外段融合蛋白表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化并行Western blot鉴定。以重组RAGE胞外段蛋白为靶分子,进行3轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选分隔良好的噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定。对获得的阳性噬菌体克隆分别进行扩增、纯化,提取DNA测序后翻译为氨基酸序列,用BLAST软件搜索Gen-Bank中的同源序列。结果成功构建并表达、纯化了RAGE胞外段融合蛋白。经过3轮筛选后,随机挑取的24个噬菌体克隆中11个可与RAGE胞外段结合。对11个噬菌体测序后用BLAST软件搜索同源序列,得到14个编码蛋白。结论应用噬菌体展示技术筛选到与RAGE胞外段相互作用的蛋白,为进一步研究其功能和作用机制提供新线索。     

APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

sKDR真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

研究获取可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)基因构建sKDR的真核表达载体,观察sKDR对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响.方法提取HUVECs总RNA,利用RT - PCR方法扩增KDR胞外免疫球蛋白1-3区基因片段,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1中,测序鉴定基因序列正确后,用脂质体法将重组质粒p...     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因片段的检测

目的 了解细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因(pbp2b)片段的检测及其意义.方法 用青霉素诱导肺炎链球菌形成L型,分离稳定L型纯培养物.提取L型染色体DNA,用肺炎链球菌pbp2b序列特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)并检测扩增产物的核苷酸序列,测得序列与GenBank公布的肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b(628 bp)序列比对.结果 肺炎链球菌稳定L型PCR扩增产物的核苷酸序列与肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b序列具有99.1%的同源性.结论 细胞壁缺陷肺炎链球菌保留了与肺炎链球菌R6菌株高度同源的种特异性pbp2b基因片段,检测该基因片段可用于肺炎链球菌稳定L型的鉴定.     

miR-186-5p对冠心病大鼠血管内皮细胞损伤及FGF2/FGFR1信号通路的影响

目的　探究微小RNA-186-5p（miR-186-5p）对冠心病（CHD）大鼠血管内皮细胞损伤的影响,以及对成纤维细胞生长因子2（FGF2）/成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）信号通路的作用。方法　48只雄性SD大鼠均分成对照组、模型组、miR-186-5p抑制剂组和miR-186-5p抑制剂NC组。除对照组外,其余组大鼠均构建CHD模型,并给予相应干预4周。测定大鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）以及血清中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α、一氧化氮（NO）和内皮素（ET）-1水平;苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠冠状动脉组织的病理学变化;Western blot法检测大鼠冠状动脉组织中FGF2、FGFR1蛋白相对表达水平;双荧光素酶验证miR-186-5p与FGF2的靶向关系。结果　对照组大鼠冠状动脉血管管壁形态均匀,无炎性细胞浸润;模型组和miR-186-5p抑制剂NC组血管内皮细胞排列紊乱,炎性细胞浸润明显;miR-186-5p抑制剂组较模型组病理变化程度减轻,炎性细胞浸润减少。与对照组比较,模型组LVEF、LVFS、HDL-C、NO水平及FGF2、FGFR1蛋白相对表达水平降低,而TC、TG、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1水平升高（P＜0.05）。与模型组和miR-186-5p抑制剂NC组比较,miR-186-5p抑制剂组大鼠LVEF、LVFS、HDL-C、NO水平及FGF2、FGFR1蛋白相对表达水平升高,而TC、TG、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1水平降低（P＜0.05）。模型组和miR-186-5p抑制剂NC组各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。双荧光素酶报告实验结果证实,miR-186-5p与FGF2存在靶向结合位点。结论　miR-186-5p的下调可减轻CHD大鼠的炎症反应和血管内皮细胞损伤,该作用与激活FGF2/FGFR1信号通路有关。     

羟苯磺酸钙对多柔比星肾病大鼠的干预及可能机制

目的观察羟苯磺酸钙对多柔比星肾病大鼠的干预效果及可能机制。方法建立多柔比星肾病大鼠模型,检测羟苯磺酸钙治疗2,4,6周后大鼠24 h尿蛋白总量及血生化指标,光镜、电镜观察肾脏病理形态学改变,免疫组织化学SABC法检测肾组织成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)表达。结果羟苯磺酸钙治疗2,4,6周后,模型大鼠一般状态及体质量显著改善。各给药组尿蛋白、总胆固醇、三酰甘油、FGF2、FGFR4均较模型组显著降低,血清清蛋白明显增加,差异有统计学意义;血肌酐、尿素氮改变差异无统计学意义。肾脏病理光镜下未见明显病变,电镜下可见足突广泛融合,治疗后明显好转。随病情进展不同时期FGF2、FGFR4与尿蛋白的变化呈密切正相关(rFGF2=0.960,rFGFR4=0.984)。结论羟苯磺酸钙治疗大鼠多柔比星肾病有效,可显著改善模型大鼠一般状态。羟苯磺酸钙通过降低FGF2、FGFR4减轻尿蛋白可能是其作用机制之一。