猫胰岛细胞的分离纯化和培养

目的建立猫胰岛细胞分离纯化和体外培养的方法。方法在自制玻棒持续振荡下常规分离胰岛细胞,进行单层细胞培养和组织块培养。采用差速贴壁法。碘乙酸法、消化时间差法去除培养中的成纤维细胞。动态收集单层细胞培养液, 分别用放射免疫法和比色法检测胰岛素和淀粉酶含量。光镜下观察５～３０ｄ细胞生长情况。分别对培养第５、１５、２１天的 细胞进行葡萄糖负荷试验、组织块培养的细胞进行透射电镜检查。结果猫胰岛细胞在体外培养可保持良好的生物学活 性３周或３周以上（组织培养）。结论　在国内首次建立的猫体外胰岛细胞培养方法可行可靠,体外培养第７～２５ｄ的细 胞形态和功能良好,是进行实验研究的极好材料。     

小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。     

高糖环境对体外培养胰岛细胞凋亡相关基因的调控

目的:观察高浓度葡萄糖对体外培养大鼠胰岛细胞凋亡相关基因的mRNA水平的调控效应.方法:应用自然沉降法和手挑法分离、纯化大鼠胰岛,分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol/L(NG组)和25 mmol/L(HG组)的条件下培养1、3、5 d,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测胰岛细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax mRNA表达.结果:(1)NG组中培养5 d组胰岛细胞Caspase-3 mRNA表达量较培养1 d和3 d组明显增高,但远比HG组低;(2)HG组中培养5 d组胰岛细胞Caspase-3和Bax mRNA水平明显增高,且呈时间-依赖关系.结论:Caspase-3、Bax表达在mRNA水平的上调可能是高糖促使胰岛细胞凋亡的一个重要机制.     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的：建立稳定可靠的耳蜗微血管内皮细胞分离培养方法。方法：采用 显微解剖法分离出耳蜗血管纹,组织块培养法进行体外培养。结果：按种后2d,部分组织块边缘有散在的细胞生长,之后细胞数逐渐增多,10d左右以组织块为中心可见成片细胞组成的细胞集落。倒置显微镜下,单个培养细胞多呈长梭形,而融合成片状单层的培养细胞排列紧密,有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观。经纯化后,95％以上的培养细胞第VIII因子相关抗原显示阳性反应。结论：本研究方法能够获取体外培养的耳蜗微血管内皮细胞。     

新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的：建立一种简单易行的自新生小鼠皮肤分离培养成纤维细胞的方法,并对分离细胞进行鉴定。方法：无菌取新生Balb/c小鼠背部皮肤,剪碎呈1 mm2大小,组织块均匀放置于培养皿并以DMEM（含10%胎牛血清）培养基对组织块进行培养;以胰蛋白酶消化分离细胞-重新贴壁法对分离培养细胞进行纯化;以NIH3T3细胞为对照,免疫荧光、流式细胞术、Western blot检测波形蛋白表达情况以对培养的成纤维细胞进行鉴定。结果：新生小鼠背部皮肤组织培养3 d时可见细胞呈细长梭形或呈多角形,组织培养5 d后可见大量细胞自组织块游离生长,组织培养7 d后可见细胞呈单层漩涡状排列或纵横交错,贴壁细胞团呈放射状生长。免疫荧光、流式细胞术、Western blot检测发现分离细胞和NIH3T3细胞均表达波形蛋白;流式细胞术证实分离的成纤维细胞波形蛋白表达阳性率和平均荧光密度分别为13.33%和9.89,而NIH3T3细胞波形蛋白阳性率和平均荧光密度分别为28.11%和14.16。结论：分离培养的细胞具有成纤维细胞的形态学特征,并表达成纤维细胞的特征分子波形蛋白。以组织块直接培养法成功自新生小鼠皮肤分离培养成纤维细胞,为建立肿瘤体外模拟微环境提供实验材料和研究基础。     

胚胎神经干细胞的分离和培养

目的：分离培养胚胎神经干细胞,探讨神经干细胞的取材方法。方珐：在解剖显微镜下,从孕11d(E11d)大鼠胚胎剥离神经管,剪成组织块进行培养,同时取部分神经管经胰酶消化后,获取细胞悬液进行单细胞培养;于培养后不同时间观察细胞的生长状况。结果：在组织块培养和单细胞培养中,接种细胞均生长良好;体外培养5d时,从组织块边缘放射状生长、迁移出细胞,并伸出突起;单细胞培养中,细胞增殖成团并长出突起连成网状。结论：组织块和单细胞培养法均可以从胚胎神经管分离、培养神经干细胞。     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的 探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化；细胞接种18h时，倒置显微镜下观察细胞生长情况；将细胞转入新的培养板培养，定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果 SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少，双硫腙可染率85％-90％，锥虫兰染色细胞活力90％以上，培养7～11d的细胞分泌功能正常。结论 用胶原酶反复短时间消化胰腺组织，细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

人胎胰岛细胞的分离培养及其意义

目的 初步探索人胎胰岛细胞的分离培养方法,以期深入研究胰岛细胞的凋亡机制及开展人胰岛细胞移植。方法 采用机械分离、体外胶原酶消化,并通过组织块联合培养、转皿、时间消化差法获取人胎胰岛细胞,观察胰岛细胞生长及开展人胰岛素释放情况。结果 双硫腙（Dithizone）染色显示胰岛纯度约80％～90％,细胞培养至7～9d为其对数生长期,培养至11d可测到胰岛素释放高峰,培养至15d仍具有一定的生物活性。结论 机械分离消化、转皿、时间消化差法可获得生物活性较好的胰岛细胞,为深入探讨胰岛细胞凋亡、胰岛细胞移植提供细胞基础。     

大鼠牙囊细胞培养方法的探讨

【目的】探讨大鼠牙囊细胞体外培养的方法。【方法】分离出大鼠牙囊组织,分别采用组织块培养法、细胞消化分散法、及改良组织块法进行牙囊细胞原代及传代培养,倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察,透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养至第3天,倒置相差显微镜观察发现,采用组织块培养法,见少数细胞从组织块爬出;而细胞消化分散法则可获得数量多的牙囊细胞,但与杂质细胞混杂生长;改良组织块法见量多、相对纯的牙囊细胞。电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网。组织块法、细胞消化分散法和改良组织块法牙囊细胞培养成功率分别为80%、60%和100%;分别于10 d、7 d和6 d左右进行第一次传代。【结论】改良组织块法是一种良好的大鼠牙囊细胞培养方法。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

兔眼角膜、结膜成纤维细胞的培养

目的 建立眼角膜、结膜细胞体外培养的方法。方法 采用组织块培养法培养兔眼角膜基质及结膜成纤维细胞。结果 结膜成纤维细胞在培养10天以后可以形成单层细胞。眼角膜成纤维细胞在培养瓶中培养2周后可形成单层；24孔板培养3d后细胞贴壁生长旺盛，10d形成单层。结论 眼角膜、结膜成纤维细胞组织块培养法是可行的，但在24孔培养板上眼角膜成纤维细胞比在培养瓶中贴壁快而且容易生长。     

大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

目的建立大鼠乳鼠背部皮肤组织和尾尖部皮肤组织成纤维细胞的体外培养方法,并比较二者的区别。方法分别取大鼠乳鼠的背部和尾尖部皮肤组织,利用组织贴块法分离和培养皮肤成纤维细胞,用酶消化法进行细胞传代培养,采用梯度温度冻存细胞。倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,用细胞骨架波形蛋白抗体进行鉴定。结果光学显微镜下3~5 d可见细胞从组织块游出,7 d细胞数量增多,10 d可贴满培养瓶壁;且大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞波形蛋白表达均为阳性。结论大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞的生物特点无差别,均可作为皮肤成纤维细胞的取材部位。     

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

目的：改进大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCS）的培养方法,了解其生长特性,为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树,去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后,采用改良组织贴块法培养ASMCS,应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d,细胞开始从组织块周围长出,5～8 d在组织块附近出现＂谷-峰＂结构,9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点,为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。     

小鼠气管平滑肌原代细胞的分离、培养与鉴定

目的：气管平滑肌细胞的异常增殖和收缩是引起气道重塑和哮喘发病的重要原因之一,本研究的目的在于建立一种可靠的通过组织块贴壁法分离培养原代小鼠气管平滑肌细胞及免疫组化鉴定的方法。方法：体式显微镜下立体分离小鼠气管平滑肌组织,组织块贴壁法培养原代细胞,对分离培养细胞通过免疫组化方法进行鉴定,并用MTT法对其增殖特性进行检测。结果：从BALB/c雄性小鼠分离气管平滑肌组织,剪碎为1mm3,用含1%青-链霉素的PBS及培养液漂洗,使组织块贴于培养皿底,并加入5mL培养液,放入37℃、5 % CO2的细胞培养箱培养,3-5天后有明显梭状细胞从组织块爬出,5-6天后,细胞可见明显“峰-谷”结构。经免疫荧光鉴定,在传代、纯化后,可得纯度为99%以上的气管平滑肌细胞。用MTT法测量其生长曲线。结论：本方法操作简单、经济,获得的气管平滑肌细胞具有较好增殖能力,细胞数量和纯度能够满足后续细胞生物学实验研究的需要。     

大鼠牙囊细胞培养方法的探讨

 【目的】探讨大鼠牙囊细胞体外培养的方法。【方法】分离出大鼠牙囊组织,分别采用组织块培养法、细胞消化分散法、及改良组织块法进行牙囊细胞原代及传代培养,倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察,透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养至第3天,倒置相差显微镜观察发现,采用组织块培养法,见少数细胞从组织块爬出;而细胞消化分散法则可获得数量多的牙囊细胞,但与杂质细胞混杂生长;改良组织块法见量多、相对纯的牙囊细胞。电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网。组织块法、细胞消化分散法和改良组织块法牙囊细胞培养成功率分别为80%、60%和100%;分别于10 d、7 d和6 d左右进行第一次传代。【结论】改良组织块法是一种良好的大鼠牙囊细胞培养方法。     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞培养方法,为有关肾损伤体外研究提供实验平台。方法 分别采用肾小管节段贴块法、胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ法消化分离肾小管节段,用含10%血清的培养基培养,然后用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,对原代和传一代肾小管上皮细胞进行鉴定。结果 三种培养方法培养细胞3 d基本贴壁,胶原酶Ⅰ法3-4 d长满瓶底,肾小管节段贴块法4-5 d长满瓶底,胰蛋白酶7 d左右。细胞均鹅卵石铺路样生长,经细胞免疫组织化学染色鉴定cytokeratin 18呈阳性。结论 肾小管节段贴块法和胶原酶Ⅰ消化都可以得到较理想的肾小管上皮细胞,后者细胞生长较快,为研究肾损伤的发生原因和机制提供实验基础。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化;细胞接种18 h时,倒置显微镜下观察细胞生长情况;将细胞转入新的培养板培养,定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少,双硫腙可染率85%~90%,锥虫兰染色细胞活力90%以上,培养7~11 d的细胞分泌功能正常。结论用胶原酶反复短时间消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

组织工程皮肤种子细胞生物学特性的研究

目的建立一种分离培齐组织工程皮肤种子细胞的方法,并对细胞的生物学特性进行研究。方法分别通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法对表皮干细胞和成纤维细胞进行分离培养,利用倒置相差显微镜和扫描电镜等对其进行形态学观察,MTT比色法对细胞的增殖动态进行测定,免疫组化法对两种细胞进行鉴定。结果分离的表皮细胞和成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖,活力较好,免疫组织化学染色为阳性。结论通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法分别获得的表皮干细胞和成纤维细胞在体外能够快速扩增、培养,可为下一步组织工程皮肤的构建提供充足、可靠的细胞源。