T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因蛋白表达

目的：检测T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗的基因表达。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c鼠随机分为pcDNA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6只），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。接种疫苗后5d，用RT－PCR法检测重组质粒mRNA表达。接种疫苗后7d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRβ8＋CpG＋脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达，而pcDNA3．1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达。结论：T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物。     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应

目的：研究T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c小鼠随机分为pcNSA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。每次免疫前及免疫开始后至第8周，取鼠血，应用间接免疫荧光检测小鼠抗体生成情况。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组、pcDNA3．1／TCRVβ＋IL－2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体，抗体滴度在第4周开始增高，第6周时达到高峰。在同一取血时间，pcDNA3．1／TCRβV8＋CpG＋脂质体组和pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组小鼠抗体滴度均高于pcDNA3．1／TCRβ8组（P＜0．001。结论：DNA重组质粒pcDN3．1/TCRVβ8可诱导小鼠产生特异性抗体淋巴瘤细胞的独特型抗体；IL－2、CpG和脂质体增强了TCRVβ8基因疫苗诱导的体液免疫反应。     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

IL-2与TCRγ独特型DNA疫苗联合诱导小鼠特异性免疫反应

目的:观察白细胞介素 2 (IL- 2)与TCRγ独特型DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗肿瘤独特型免疫反应。方法: 24只 6~8周的健康纯系雄性BALB/c小鼠随机均分为 3组,在小鼠双侧股四头肌肌内注射 2. 5g/L盐酸布比卡因,每侧 50μl, 1次 /d, 5d后分组免疫。各小鼠分别于第 1周、2周、4周各免疫 1次,共 3次。①A组: 每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 100μg; ②B组:每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 TCRγ100μg;②C组:每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 -TCRγ100μg及IL 2 5μg。于末次免疫接种后第 5d将每组小鼠随机选 2只处死,分离出胫前肌,RT PCR法检测重组质粒在小鼠骨骼肌中的mRNA表达;间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况。结果:在pcDNA3. 1 TCRγ组及pcDNA3. 1- TCRγ+IL- 2组小鼠中用RT PCR法均检测到了重组质粒在肌肉中的mRNA表达。pcDNA3. 1- TCRγ组及pcDNA3. 1 -TCRγ+IL 2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体。在第 6周时,pcDNA3. 1 -TCRγ组小鼠抗体滴度最高达 1160;pcDNA3. 1 TCRγ+IL 2组小鼠抗体的滴度最高达 1640, 2组差异有统计学意义 (P< 0. 01 )。结论:TCRγ表达载体pcDNA3. 1 -TCRγ可以诱导小鼠产生特异性抗淋巴瘤细胞独特型抗体;应用IL -2免疫佐剂可使TCRγ独特型DNA疫苗     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC-1／HN株泉殖子表面蛋白-2(MSP-2)DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒PBK／MSP-2经骨骼肌注射BALB／c小鼠。小鼠经DNA疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生。结果 与对照组相比，疫苗组CD4^ CD8^ 淋巴细胞有显著性的增高，体外培养的脾脏细胞IFN-γ有高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC-1／HN MSP-2 DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫疫答类型。     

新型呼肠病毒S基因DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性

目的 探讨新型呼肠病毒R4株S片段免疫小鼠后引发的免疫应答。方法 构建4个不同S基因节段的重组真核表达质粒,并免疫小鼠;ELISA检测血清以研究R4特异性抗体升高水平,并对其抗体亚型进行鉴定;ELISPOT检测小鼠淋巴细胞INF-γ的表达情况。结果 与对照组相比,4个重组质粒免疫的小鼠血清都有明显的R4特异性抗体升高,尤其以S1和S3基因免疫后抗体水平较高,且均以IgG2a占绝对优势;S1基因免疫组小鼠的细胞免疫应答最强。结论 S1基因重组质粒免疫小鼠后可同时引发较强的体液免疫和细胞免疫应答,是较为理想的疫苗备选基因片段。     

小鼠T细胞淋巴瘤在同基因鼠内传代的遗传学分析

作者研究了甲基亚硝基脲（ＭＮＵ）诱发ＲＦ／Ｊ系小鼠Ｔ细胞淋巴瘤及肿瘤细胞在同基因小鼠体内连续传代后的染色体变化。胸腺肿瘤细胞及其传代培养细胞染色体异常，皆发生在１５、１４、Ｘ、１、５、６、３号染色体，说明这些染色体含有促进肿瘤多步发生过程的基因即癌基因及抑癌基因。ＭＮＵ不仅具有组织特异性而且累及特异染色体，结果也说明相同组织病理类型的肿瘤可产生于不同的特定位点的基因变化。     

IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价

目的 评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBV DNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果.方法 HBV Tg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S pFP、pS2.S PcDNA3.1免疫治疗和PcDNA3.1对照组.联合免疫质粒总剂量40 μg/只,按1:1比例混合接种.初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答.结果 HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S pFP组免疫第8周(13 317±2 539)拷贝/ml、第12周(6 462±3 359)拷贝/ml时分别较免疫前(36 159±7 769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S pcDNA3.1组第4周(20 618±9 523)拷贝/ml及第8周(23 818±5 319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36 090±4 421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27 691±13 071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S pFP组Tg小鼠个体血清HBV DNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的 升高.结论 Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBV DNA疫苗抑制Tg鼠HBV DNA复制和表达的治疗作用.     

恶性疟原虫重组质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS在小鼠骨骼肌的表达

目的 观察恶性疟原虫海南分离株(FCC1／HN)裂殖子表面蛋白2(MSP2)融合HBsAg基因片断真核表达质粒pVXORF1-PiMSP2-HBS在小鼠骨骼肌的表达。方法KM小鼠分3组，用0．5％盐酸布比卡因对3组小鼠行预处理后，在同一部位Ⅰ组注射浓度为1μg／μl的重组质粒pVXORF1-PiMSP2-HBS100μl，Ⅱ组注射浓度为1μg／μ的质粒pVXORFI1-HBS100μl，Ⅲ组为正常对照组，注射pH7．4PBS100μl。分别在免疫后4周和8周用免疫组织化学实验检测小鼠注射部位肌肉组织中重组蛋白MSP2的表达。结果小鼠经DNA疫苗注免疫4周和8周后肌肉组织呈特异性阳性反应。结论重组质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS免疫小鼠后，肌肉组织有重组蛋白MSP2的表达。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

目的制备在大肠杆菌中高效表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）克隆技术,将６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因克隆到原核高效表达载体ｐＫＰＬ３ａ上,重组子转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,温度诱导表达;复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度;直接法和竞争抑制法ＥＬＩＳＡ检测其活性。结果６Ｂ１１ｓｃＦｖ以包涵体形式表达获高效表达;包涵体经溶解复性纯化,纯度达９５％以上;表达蛋白能与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原ＯＣ１６６－９与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９的特异结合。结论６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因可在原核细胞中高效表达,表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。     

口服Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达

目的：检测Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达,探索口服疫苗在肠道局部的摄取方式。方法：将C57BL/6小鼠随机分为2组,即生理盐水组和脂质体包裹重组质粒组。分别将生理盐水和脂质体包裹pCDNA3.1＋/Ag85A以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14 d,末次免疫后14 d处死小鼠,取肠,用免疫荧光方法检测Ag85A在肠道局部M细胞的表达。结果：Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道局部M细胞有表达。结论：口服脂质体包裹的DNA疫苗可以被肠道M细胞摄取。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的 :克隆小鼠血管抑素 (Angiostatin)cDNA ,构建其真核表达载体pCMV -Angiostatin重组质粒 ,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法 :根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列 ,用RT -PCR方法从鼠肝脏中扩增出AngiostatincDNA ,连接 pMD18T载体测序 ,经测序证实后 ,通过中间载体 pKS ,构建pCMV -Angiostatin重组质粒。结果 :测序表明扩增的AngiostatincDNA序列与报道基本一致 ,AngiostatincDNA正确插入表达载体。 结论 :成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建     

LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

骨骼肌外周T细胞淋巴瘤一例及文献回顾

原发骨骼肌T细胞淋巴瘤少见,对其治疗仍然遵循非霍奇金淋巴瘤的治疗原则,即以含葱环类的CHOP方案为主。     

屋尘螨过敏原DNA疫苗对哮喘模型小鼠Foxp3+调节性T细胞功能的影响

目的 观察编码屋尘螨主要过敏原Der p1和Der p2的质粒DNA疫苗对哮喘小鼠脾细胞Foxp3 调节性T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)功能的影响.方法 以屋尘螨提取液复制哮喘模型后,将编码Der p1、Der p2的真核表达质粒pDs-Der p1、pCI-neo-Der p2等量混合接种小鼠后对小鼠进行再次激发.分离小鼠脾脏细胞,以流式细胞仪方法检测CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞比例.采用磁珠法分离CD4 CD25 T细胞,流式细胞仪检测其Foxp3基因的表达,并以IL-2进行刺激观察其增殖反应,测定其上清液中的IL-10、TGF-β含量.将分离的Treg细胞与哮喘小鼠CD4 CD25-T细胞共同培养,观察Treg细胞对CD4 CD25-T细胞增殖及IL-4、IL-5、IFN-γ的影响.结果 哮喘组小鼠脾脏CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞比例显著低于对照组,经DNA疫苗治疗后CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞显著增加.体外培养发现各组CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞增殖能力均显著低于CD4 CD25-T细胞,培养液上清中均未检测到IL-10和TGF-β存在.3组CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞均可显著抑制哮喘CD4 CD25-T细胞的增殖及IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌,但在3组Treg细胞中,哮喘组Treg细胞作用显著低于其他两组.结论 Treg细胞可显著抑制哮喘CD4 CD25-T细胞的增殖及炎性介质的分泌,哮喘小鼠不仅出现CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞数量的减少,而且其功能也可能出现缺陷.DNA疫苗治疗可以诱导CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞增加,并恢复其功能活性.     

鼻腔NK/T细胞淋巴瘤T-bet基因扩增及特异表达的研究

目的 探索鼻腔NK／T细胞淋巴瘤（N-NK／T—L）特异基因改变及其表达变化。方法 对同一病例的N-NK／T-L肿瘤细胞和外周血白细胞进行限制性酶切路标基因组扫描（RIGs），并结合相应虚拟基因组扫描（VGS）生物信息分析，及基因库检索确定异常基因信号；通过对上述结果发现的异常基因进行克隆和探针制备，对3例新鲜N—NK／T-L肿瘤组织和1例外周血标本进行了Southern和斑点印迹杂交分析，并对20例石蜡组织N-NK／T-L以及对照组包括17例同部位B细胞淋巴瘤、3例正常脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织进行了原位杂交检测。结果 RLGS和VGS法显示N-NK／T-L肿瘤细胞中存在T-bet基因异常；经Southem和斑点印迹杂交检测证明在3例新鲜N-NK／T-L肿瘤细胞中有T-bet基因扩增；原位杂交显示T-bet基因在20例N-NK／T-L中阳性表达者为18例（90．0％），而B细胞淋巴瘤中仅为2例（11．8％），两者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。在3例脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织中均未有T-bet表达。结论T．bet基因在N-NK／T-L肿瘤细胞中存在基因扩增和过表达，T-bet基因的异常表达可能在N-NK／T—L的发生中起一定作用，并有必要对其是否可作为分类依据和辅助诊断的指标做进一步研究。     

VEGF基因在非特指外周T细胞淋巴瘤中的表达及意义

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)在非特指外周T细胞淋巴瘤中的表达及意义。方法应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术分别检测非特指外周T细胞淋巴瘤中VEGFmRNA及其蛋白水平的表达情况,用CD34单克隆抗体标记肿瘤血管计算其微血管密度(MVD),用SPSS10.0软件分析VEGF表达与该肿瘤微血管密度、临床特征及预后的关系。结果(1)20例非特指外周T细胞淋巴瘤中有14例(70.0%)VEGFmRNA表达上调,13例(65.0%)肿瘤细胞VEGF蛋白表达阳性;(2)VEGF表达与该肿瘤微血管密度呈正相关(r=0.8,p=0.0270);(3)VEGF表达与该肿瘤的临床分期、B症状及血清乳酸脱氢酶(LDH)有关(p=0.034,p=0.013和p=0.007);(4)Cox多因素相关分析显示,年龄>60岁和VEGF表达上调为预后不良因素(p=0.040和p=0.027)。结论VEGF在非特指外周T细胞淋巴瘤中广泛表达,可能与该肿瘤的临床特征和预后关系密切。     

乙肝病毒表面抗原基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答的研究

为观察乙肝病毒 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 基因疫苗免疫小鼠后的细胞及体液免疫应答,将该疫苗定向克隆于质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 巨细胞病毒启动子下游,构建能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 。将此疫苗通过多点肌肉注射免疫 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠后第六周,实验组小鼠均出现抗－ Ｈ Ｂｓ Ｉｇ Ｇ 阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时 Ｔｈ１ 免疫应答相关的细胞因子 Ｉ Ｌ２ 及γ干扰素水平也明显高于对照组,表明本文构建的基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 能诱导 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。     

NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达

目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.